FADD磷酸化在其非凋亡功能中的作用研究

摘要

具有死亡功能区的Fas相关蛋白(Fas-associating protein witha novel deathdomain，FADD)，最早是作为凋亡过程中的衔接蛋白被人们所熟知。随着研究的进一步深入，发现FADD也参与了多种非凋亡有关的细胞进程。南京大学华子春课题组围绕FADD的新生物学功能取得了多项研究进展。
　　在此基础上，本文以构建6种过表达载体为起点，以果蝇作为模式动物，采用标准的显微注射技术，构建转基因果蝇模型，并进一步研究磷酸化FADD的非凋亡功能。
　　首先，构建老鼠全长的FADD(mFADD)、持续磷酸化mFADD(S191D)、持续非磷酸化mFADD(S191A)、C末端敲除的mFADD、BG4、及选择标记c-myc（对照）6种过表达载体，我们根据鼠FADD基因序列并利用重叠延伸PCR定点突变方法，获得磷酸化mFADD、非磷酸化mFADD、C末端敲除的mFADD及序列正确的BG4。将各形式的FADD片段通过PCR扩增后，连接到载体pUASTattB中。
　　其次，采取标准的显微注射技术，注射24872（2号染色体定点突变）果蝇胚胎，以橘黄眼或红眼为转基因的标记表现型，获得过表达mFADD、C末端敲除、pFADD、npFADD、BG4、c-myc的转基因果蝇。
　　第三，制备dFADD基因敲除果蝇，利用CRISPR/Cas9技术，采取标准的显微注射技术，注射到果蝇54591（持续表达Cas9的转基因果蝇）胚胎中，待幼虫羽化后逐个逐代进行杂交鉴定。
　　第四，分析上述六种过表达转基因果蝇的遗传性状:
　　(1)转基因果蝇遗传表型分析:对眼睛及翅膀表型分析，结果显示部分FADD-D果蝇翅膀出现卷曲现象，但对果蝇眼睛并没有明显的影响。
　　(2)对细胞周期的影响:检测细胞周期相关蛋白cyclinA、cyclinE mRNA的表达情况，观察是否发生表达紊乱;
　　(3)天然免疫中的作用分析:检测参与Imd途径的Dredd蛋白mRNA的表达水平;
　　(4)糖代谢相关酶的表达变化:检测果蝇中糖代谢相关酶G6pc、Pepck mRNA的表达变化;
　　(5)攀爬、寿命分析:统计结果表明，FADD-D果蝇攀爬能力下降、寿命变短，并且各转基因果蝇攀爬能力及寿命较对照组都有明显下降趋势;
　　最后，获得在dFADD knock down(RNAi)的基础上，过表达FADD的转基因果蝇:分别将dFADD knock down的果蝇、各种过表达的转基因果蝇与含双平衡子工具果蝇杂交。根据平衡子的表型特征，挑选子一代果蝇，将子一代杂交得到子二代果蝇，从而获得我们预期的转基因果蝇。
　　综合以上研究结果，我们认为FADD磷酸化对果蝇的寿命及运动能力产生影响。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

绪言

第一部分 文献综述

一、FADD及其凋亡功能

二、FADD磷酸化的非凋亡功能研究进展

小结

第二部分 实验材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

第三部分 实验结果与讨论

第一章 FADD过表达转基因模型的建立

前言

结果

讨论

第二章 CRISPR／Cas9基因敲除FADD果蝇模型的建立

前言

结果

第三章 FADD过表达果蝇模型遗传性状的初步分析

前言

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介