果蝇PTIP蛋白在PcG/trxG转录调控中的作用

摘要

PTIP蛋白，又名为PAXIP1(Homo sapiens)，全称PAX Transcription activation domainInteracting Protein，含有6个BRCT结构域和中间的poly-Q区域。已有的研究表明PTIP蛋白可以通过招募多种蛋白质参与不同的生理过程，例如N端2个BRCT与PA1组成的复合物参与免疫球蛋白重链(IgH)类型转换重组(CSR)，C端的BRCT与53BP1相互作用参与DNA损伤应答与修复，还与组蛋白修饰相关的蛋白ALR(MLL2)、MLL3/MLIA和UTX等组蛋白甲基化转移酶(HMT)或组蛋白去甲基化酶相互作用，提示PTIP可能在转录调控中具有重要作用。
　　我们实验室前期在果蝇中鉴定出了一个小鼠ptip的直系同源基因，ptip基因敲除的果蝇表现出胚胎蛹前期致死，而mPtip可以拯救ptip突变果蝇。最近的报道提示在果蝇中PTIP可能属于TRR/COMPASS复合物，具有H3K4me3的催化活性，可以调控基因的激活。这与我们实验室前期发现ptip在果蝇发育中的发挥作用并调控果蝇发育相关基因如even skipped，fushi tarazu和Engrailed的表达等研究结果相吻合。
　　本文中，我们为了进一步研究ptip在PcG/trxG转录调控中可能涉及的表观调控机制，将利用果蝇遗传学研究ptip和PcG在果蝇翅膀中的遗传学相互作用。同时利用细胞实验探讨ptip在转录调控中所处的地位。以下是本论文的主要结果:
　　1.ptip的突变能增强PcG突变所具有的翅膀表型
　　PcG成员突变后会导致雄性果蝇的第二及第三对足上出现多余的性梳，这种表型称为同源异形转化。ptip突变体本身不具有这种同源异形转化表型，而前期我们发现ptip在性梳表型上有增强PcG的功能。基于这个发现，我们利用了另一PcG相关的翅膀表型进一步验证了ptip在PcG转录调控中的作用，并发现ptip的不同突变体ptipPBac和ptipDf对Pc突变体pc3在翅膀表型上都具有增强的作用。另外，我们做了PcG靶基因Ubx的免疫染色实验，结果发现ptip突变能显著增强Pc突变造成的Ubx异位表达。因此我们进一步确认了ptip对PcG抑制功能的协同作用，并从分子/基因水平对这一遗传学的相互作用做出了解释。
　　2.ptip影响果蝇Kc细胞中管家基因的表达
　　为了研究ptip遗传学上增强PcG的可能机制，我们利用Kc细胞RNAi实验从mRNA水平检测了ptip对PcG/trxG转录调控的影响。首先，我们实验室已经知道ptip knockdown(KD)对许多PcG靶基因的表达都有一定影响，本文又发现ptip KD对于多种管家基因如actin、gapdh、rp49、却的表达也都有一定影响，这说明ptip可能普遍对于基因的激活是必需的。同时，Ubx的mRNA表达结果表明ptip共KD能明显增强Pc KD的作用，这一结果与本文翅膀表型的结果相对应但与我们前期tip在分子水平去阻遏的研究结果相反。我们认为这些结果揭示出ptip功能有一定复杂性，而它在PcG/trxG动态平衡的转录调控中具有重要作用。
　　综上所述，这些在体和细胞的实验数据表明PTIP蛋白对于细胞生长或分化起着重要作用。PTIP蛋白影响管家基因的表达或许可以解释果蝇和哺乳动物ptip突变早期致死的原因。我们目前最为感兴趣的是PTIP所调控的靶基因和具体的功能，这也将是我们未来研究的重点。总而言之，本文的实验结果有助于我们更好地理解PTIP蛋白具体功能。

目录

声明

摘要

绪言

第一章 文献综述

1．1．PTIP蛋白的结构分析

1．1．1．PTIP蛋白的不同结构域

1．1．2．BRCT结构域的结构与功能分析

1．1．3．PolyQ结构域的结构与功能分析

1．2．PTIP蛋白的功能分析

1．2．1．PTIP对于胚胎发育的影响

1．2．2．PTIP蛋白相互作用的研究

1．2．3．PTIP与DNA损伤修复

1．2．4．PTIP与IgH基因类别转换重排

1．2．5．PTIP与组蛋白修饰

1．3．PTIP蛋白与PcG、trxG的相互作用关系

1．3．1．PcG和trxG蛋白复合物

1．3．2．PTIP与PcG和trxG在果蝇遗传学的相互作用

1．4．PTIP蛋白研究的展望

第二章 实验材料和方法

2．1．实验材料及试剂

2．1．1．宿主菌及细胞系

2．1．2．质粒

2．1．3．果蝇品系

2．1．4．培养基(本实验室标准配方)

2．1．5．细胞RNAi相关试剂

2．1．6．Co-IP相关试剂

2．1．7．Western Blot免疫印迹所需缓冲液

2．1．8．ChIP相关试剂

2．1．9．GST融合蛋白纯化相关试剂

2．1．10．免疫染色抗体

2．1．11．果蝇基因组提取试剂

2．1．12 质粒提取所需缓冲液

2．1．13．分子克隆试剂和试剂盒

2．1．14．主要仪器设备

2．1．15．本文所使用的引物序列

2．2．实验方法

2．2．1．果蝇遗传学

2．2．2．细胞RNAi实验

2．2．3．Co-IP实验

2．2．4．Western Blot免疫印迹

2．2．5．ChIP实验

2．2．6．GST融合蛋白纯化实验

2．2．7．果蝇三龄幼虫成虫盘的免疫染色

第三章 实验结果及讨论

3．1．引言

3．2．PTIP与PcG家族相互作用关系分析

3．2．1．前言

3．2．2．PTIP与Pc遗传学相互作用

3．2．3．讨论

3．3．PTIP的转录调控作用分析

3．3．1．前言

3．3．2．PTIP对House keeping基因的影响

3．3．3．PTIP对PcG靶基因ubx的影响

3．3．4．讨论

3．4．工作总结与展望

3．4．1．工作总结

3．4．2．工作展望

参考文献

作者简介

致谢