FoxG1在小鼠耳蜗毛细胞发育及存活中的机制研究

摘要

先天性听力缺陷是新生儿出生缺陷的重要方面，其发病率位居新生儿出生缺陷之首。听力损失主要分为感音神经性听力损失和传导性听力损失。目前研究表明，新生儿听力缺陷的病因主要与遗传因素尤其是耳聋相关基因突变、线粒体的遗传因素、外周的听神经病和引起传导性听力损失的疾病有关。因此对听觉相关基因功能和聋病的分子机制研究有重要的意义。
　　FoxG1是Fox家族的一个重要成员，位于许多基因的上游，可通过与非编码序列的结合从而对多种转录因子的表达进行调控，所以FoxG1在早期神经发育中具有重要的调节作用。FoxG1与多种神经发育障碍性疾病有关，如Rett综合征、癫痫及小头畸形。在FoxG1全身性敲除小鼠中发现大脑皮质、端脑、耳、视网膜、嗅觉上皮细胞等组织的神经发育均受影响，并在出生后死亡。目前研究发现FoxG1全身性敲除小鼠的内耳发育出现严重畸形，如蜗管变短、毛细胞的排数增多、前庭缩小、轴突的生长和前庭神经元的定位出现异常、外骨壶腹缺失、毛细胞极性改变等。但是FoxG1全身性敲除是胚胎致死的，这就为研究FoxG1在出生后毛细胞发育及存活的相关机制带来了困难。我们通过Gficre小鼠与FoxG1loxp/loxp交配得到毛细胞条件性敲除FoxG1小鼠，避免了FoxG1对个体存活的影响，在此基础上进一步研究FoxG1基因在毛细胞发育及存活中发挥的功能，并对毛细胞发育相关通路因子进行检测，从而在毛细胞中对FoxG1的作用机制进行更加深入的研究。
　　我们首先对Gficre小鼠的Cre酶活性及敲除效率进行了鉴定，结果显示Gfi-Cre可激活tdTomato的表达，同时对FoxG1loxp/-Gficre小鼠与FoxG1 loxp/loxp小鼠交配所得子代耳蜗解剖后发现FoxG1被显著敲除。我们还发现在FoxG1 CKO的新生鼠(p1、p7)的耳蜗顶圈及部分中圈外毛细胞出现多排分布，且这些多余的毛细胞会随着发育时间而逐渐减少。另外，我们发现FoxG1 CKO的小鼠在成年后听阈随着发育时间延长逐渐升高，并伴随着毛细胞的缺失，且缺失程度会随着小鼠年龄增长而逐渐加重，通过对不同时期耳蜗进行TUNEL染色发现FoxG1缺失后凋亡细胞会出现增加，凋亡因子的表达水平升高。我们对P1时期的小鼠进行了RNAseq分析，发现在FoxG1缺失后多个信号通路的表达出现异常，说明FoxG1对毛细胞发育的影响是通过多个信号通路的协同调控实现的，其中Notch信号通路因FoxG1的缺失而被显著抑制，因此导致细胞的过度分化，这也是引起毛细胞增多的原因之一。此外，IGF、Wnt、EGF等信号通路相关基因表达也受到了抑制，说明FoxG1的正常表达对毛细胞的存活是非常重要的，FoxG1缺失后毛细胞的凋亡敏感性增加。以上研究为深入研究耳蜗发育机制及FoxG1基因的功能提供了新的线索及依据。

目录

声明

摘要

主要英文缩写词

第一章 文献综述

第一节 内耳及毛细胞的结构和发育过程

1．1 内耳构成

1．2 耳蜗毛细胞与声音传导

1．3 内耳及耳蜗毛细胞的发育

1．4 耳蜗毛细胞的来源

1．5 耳蜗毛细胞发育与多种信号通路调控

1．6 耳蜗毛细胞发育相关的重要基因

1．7 未来研究展望

第二节 FoxG1在其它组织中的作用及机制研究

2．1 FoxG1生物信息学背景

2．2 FoxG1在其它组织中的功能

2．3 与FoxG1相关的信号通路或基因

2．4 未来研究展望

第三节 FoxG1对内耳发育的影响

3．1 FoxG1在内耳的表达

3．2 FoxG1缺失后对内耳表型的影响

3．3 结论与展望

第二章 实验材料和方法

第—节实验材料及试剂

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂

1．3 主要耗材

1．4 试剂配置

第二节 实验方法

2．1 小鼠基因型鉴定

2．2 成年小鼠耳蜗铺片免疫荧光

2．3 新生小鼠耳蜗铺片免疫荧光

2．4 小鼠耳蜗毛细胞流式分选

2．5 耳蜗毛细胞RNA提取

2．6 RT-PCR

2．7 ABR检测

2．8 凋亡细胞TUNEL染色

2．9 实验小鼠的准备

2．10 统计学分析方法

第三节 实验路线

第三章 实验结果和讨论

第一节 FoxG1敲除后引起新生鼠耳蜗表型变化

1．1 Gfi-Cre小鼠的解析

1．2 Cre重组酶的重组活性鉴定

1．3 FoxG1敲除小鼠的构建

1．4 新生鼠耳蜗毛细胞中Cre酶对FoxG1敲除效率的解析

1．5 FoxG1缺失后P1小鼠耳蜗毛细胞的表型变化

1．6 FoxG1缺失后P7小鼠耳蜗毛细胞的表型变化

1．7 FoxG1缺失后对小鼠蜗管长度的影响

第二节 FoxG1敲除后对成年鼠耳蜗毛细胞存活的影响

2．1 FoxG1 KO小鼠出生后不同时期听力的变化

2．2 FoxG1缺失后P21-P45小鼠耳蜗毛细胞的表型变化

2．3 FoxG1缺失后P60-P120小鼠耳蜗毛细胞的表型变化

2．4 FoxG1缺失后P21-P45小鼠耳蜗毛细胞的凋亡检测

2．5 FoxG1缺失后P60-P120小鼠耳蜗毛细胞的凋亡检测

第三节 FoxG1敲除后毛细胞转录组测序分析

3．1 耳蜗毛细胞的流式分选

3．2 基因显著GO富集分析

3．3 信号通路相关基因表达差异分析

3．4 FoxG1缺失后对P1小鼠耳蜗毛细胞β-catenin表达影响

3．5 FoxG1缺失后对成年小鼠耳蜗毛细胞IGF信号通路及凋亡因子表达影响

第四章 小结与展望

参考文献

致谢

作者简介

攻读博士学位期间发表的论文