脑内肥大细胞对大鼠骨折后血脑屏障与学习记忆的影响

摘要

术后认知功能障碍（Postoperative cognitive dysfunction，POCD）是患者手术后出现的神经系统并发症，年龄和严重手术创伤是POCD的两大主要危险因素。尽管目前POCD的确切机制尚不清楚，但外周手术创伤引起的中枢神经炎症在POCD的发生发展中扮演重要的角色。血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)由连续的内皮细胞层及细胞间紧密连接构成，因具有选择通透性而保护大脑免受外来毒素和病原体的侵害，为中枢神经系统(central nervous system，CNS)行使正常功能提供一个稳定的环境。研究表明，BBB的功能破坏可能与老化相关的认知功能障碍相关，且手术会增加BBB通透性，损坏其正常功能。肥大细胞分布于人体很多部位，包括CNS。在CNS，肥大细胞位于血管周围，即BBB的脑组织侧，能在第一瞬间捕捉到血液中的免疫信号，以胞吐方式脱颗粒释放组胺、类胰蛋白酶等介质，成为中枢炎症反应的起始者和催化剂。有大量证据表明，肥大细胞能促进BBB的破坏。因此我们假设，手术创伤后肥大细胞的激活破坏了BBB的完整性，参与了中枢神经炎症以及认知功能损伤的过程。
　　目的:探讨肥大细胞对BBB的影响以及在POCD中的作用。
　　方法:(1)将128只雄性SD大鼠随机分为四组:对照组（Ctrl组）、色甘酸钠组（Cro组）、手术组（Op组）、色甘酸钠+手术组（Cro+op组）;根据手术后观察时间点的不同，每组大鼠再分为1天和3天两个亚组，每个亚组16只。(2)所有大鼠侧脑室立体定位置管，一周后经套管针给药，Cro组和Cro+op组侧脑室注射色甘酸钠溶液2μl（100μg/ul），Ctrl组和Op组给予等体积生理盐水。(3)侧脑室给药后30分钟，Op组和Cro+op组行胫骨骨折手术。(4)采用甲苯胺蓝染色和类胰蛋白酶组织化学染色两种方法检测肥大细胞活化数目;采用Y迷宫和场景性恐惧逃避实验检测大鼠的学习记忆能力;采用实时定量PCR检测大鼠海马组织炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达;以Evans blue(EB)染料溢出定量测定检测BBB通透性的改变;Western blot法分别检测大鼠海马紧密连接蛋白occludin和claudin-5、金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的水平，免疫组织化学染色法观察海马CA1区的MMP-2和MMP-9的变化。
　　结果:与Ctrl组相比，Op组大鼠术后1天和3天，两种染色方法均显示海马CA1区肥大细胞数目明显增多（1天，P＜0.01;3天，P＜0.01）;与Op组相比，Cro+op组大鼠术后1天和3天海马中肥大细胞的数量均明显减少（1天，P＜0.01;3天，P＜0.05或P＜0.01）。与Ctrl组相比，Op组大鼠术后1天和3天的恐惧逃避实验和Y迷宫实验结果均显示学习记忆能力下降(P＜0.01);与Op组相比，Cro+op组大鼠术后1天和3天的学习记忆能力均明显改善（1天，P＜0.01;3天，P＜0.05或P＜0.01）。与Ctrl组相比，术后1天，Op组大鼠海马TNF-α和IL-1β的mRNA表达均明显增高(P＜0.01);与Op组相比，Cro+op组的海马TNF-α和IL-1βmRNA表达均明显减低(P＜0.01);术后3天，Op组大鼠海马IL-1β的mRNA表达依然高于Ctrl组(P＜0.01)，与Op组相比，Cro+op组大鼠海马IL-1β的mRNA表达明显减低(P＜0.05)。与Ctrl组相比，在术后1天，Op组大鼠海马EB含量明显增多(P＜0.01); Cro+op组则明显减少海马EB染料的渗出(P＜0.01）;在术后3天，四组大鼠之间没有差异(P＞0.05)。与Ctrl组相比，术后1天Op组大鼠海马occludin和claudin-5的表达均明显减少(P＜0.01)，MMP-2和MMP-9的表达均明显增多(P＜0.01，);Cro+op组均明显减轻上述变化(P＜0.05或P＜0.01)。同时，免疫组织化学染色法显示，在术后1天，Op组大鼠海马CA1区MMP-2和MMP-9的表达均明显增加(P＜0.01); Cro+op组均明显减轻上述变化(P＜0.05）。
　　结论:本研究结果提示，胫骨骨折术后1-3天大鼠脑内海马的肥大细胞明显增多。这与血脑屏障破坏，海马的炎症及动物学习记忆能力的下降有关。

目录

声明

中英文缩略词对照表

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1．胫骨骨折手术对大鼠海马CA1区肥大细胞数目的影响

2．胫骨骨折手术以及色甘酸钠预处理对术后大鼠学习记忆能力的影响

3．胫骨骨折手术以及色甘酸钠预处理对术后大鼠海马TNF-α和IL-1β mRNA水平的影响

4．胫骨骨折手术以及色甘酸钠预处理对术后大鼠海马Evans blue(EB)渗出的影响

5．胫骨骨折手术以及色甘酸钠预处理对大鼠海马紧密连接蛋白occludin和claudin-5的表达的影响

6．胫骨骨折手术以及色甘酸钠预处理对大鼠海马金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达的影响

讨论

参考文献

结论

综述 术后认知功能改善的研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢