多靶点多肽--阿霉素复合物的制备及其逆转乳腺癌多药耐药的研究

摘要

阿霉素(Doxorubicin，DOX)在临床上被广泛使用，常作为治疗癌症的一线药物。但是由于阿霉素在治疗过程中易出现多药耐药的现象，导致近年来阿霉素的使用受到了很大程度的限制。多药耐药发生的机制主要包括ATP结合盒蛋白(ATP-binding cassette，ABC)转运体如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的过表达和细胞凋亡抑制。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，作为细胞凋亡信号通路上关键的蛋白质分子之一，靶向抑制其表达也成为目前具有吸引力的治疗肿瘤的理念。本研究中设计了一条具有双靶点的杂合肽HAIYPRHGGCGMPKKKPTPIQLNP(T10-ERK)，其是由ERK多肽抑制剂MPKKKPTPIQLNP，一段含有巯基的连接序列(GGCG)和转铁蛋白受体(Transferrin Receptors，TfR)靶向的多肽组合而成。将这条巯基修饰的杂合肽共价结合到DOXO-EMCH上，形成一个新型的多肽-阿霉素复合物T10-ERK-DOX，DOXO-EMCH是阿霉素的6-马来酰亚胺己酰腙衍生物。本研究通过氢谱核磁1HNMR，液相串联质谱(Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS)和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)对T10-ERK-DOX的结构和性质进行了确证。利用乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR作为体外模型，将皮下移植MCF-7/ADR细胞的裸鼠作为体内模型，评价T10-ERK-DOX逆转耐药的能力，并与DOX和T10-DOX比较。结果显示，体外试验中T10-ERK-DOX具有更低的IC50值(20.8±1.1 mM)，体内抑瘤实验抑制程度也更明显（抑制率为72.2±4.6％），而疗效的提高可能是由于激活了不同的凋亡信号通路。此外，考虑到我们之前的研究显示T10-DOX本身就具有逆转耐药的能力，我们对ERK多肽抑制剂逆转耐药的能力也单独进行了评价，结果显示ERK多肽抑制剂和T10-DOX联用后具有一定的加和作用，提高了肿瘤对药物的敏感性，增强了对肿瘤的治疗效果，逆转了耐药。本研究中多靶点策略的成功意味着经合理设计的多靶点药物在癌症治疗中更具有潜力。

目录

声明

摘要

前言

1．材料和方法

1．1 试剂

1．2 仪器

1．3 多肽-阿霉素复合物的制备

1．5 细胞培养

1．6 细胞毒性试验

1．7 细胞内阿霉素的摄取

1．7．1 免疫荧光

1．7．2 细胞内阿霉素的提取

1．8 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法

1．9 T10-ERK对药物耐药的影响

1．9．1 蛋白免疫印迹(Western blotting)

1．9．2 细胞增殖抑制试验

1．9．3 流式细胞试验检测P-gp表达

1．10．1 抑瘤实验

1．10．2 药物体内分布试验

1．10．3 药物代谢动力学

2．结果

2．1 多靶点杂合肽-阿霉素复合物表征

2．2 T10-ERK-DOX对MCF-7／ADR细胞的细胞毒性

2．3 T10-ERK-DOX引起的细胞凋亡

2．5 杂合肽T10-ERK对药物耐药的影响

2．6 体内抑瘤试验和药物分布试验

3．讨论

4．结论

参考文献

综述 多靶点药物研究进展

硕士研究生期间发表文章情况

致谢