饮食模式和遗传变异对非职业人群POCs内暴露水平的影响

摘要

研究背景:
　　持久性有机氯化合物(POCs)是一类被禁止使用多年的持久性有机污染物(POPs)，包括有机氯农药(OCPs)和多氯联苯(PCBs)，可持续存在于水体、土壤和大气中并广泛扩散。由于POCs的脂溶性较强，可在生物体和人体内长期蓄积难以降解，并通过食物链进行富集和生物放大作用，导致人群的长期低剂量暴露。研究表明，POCs具有致癌性、生殖毒性和神经毒性等，还可能与糖尿病、高血压等慢性疾病相关。内暴露检测是评估人体污染物暴露负荷的较为准确的方法，也是评价环境污染物与人群健康危害关系的重要手段。研究显示，年龄、性别、生活习惯和饮食方式都是影响污染物体内含量的重要因素。由于POCs的挥发性较低，对于非职业人群而言，膳食摄入是其暴露的主要途径，尤其是鱼类、肉类摄入，其摄入量受食物污染水平和食物消费量的影响。膳食模式是综合评估人群摄入的各种食物的含量和比例的研究方法，不同膳食模式可通过影响污染物的内暴露含量而影响机体的健康状态。此外，遗传因素也可能与污染物的内暴露有关，特别是代谢酶的基因变异可通过改变酶的表达和/或代谢活性而改变体内化合物原形及代谢产物量，影响健康危害结局。全基因组关联研究(GWAS)是目前研究复杂疾病性状的有效手段，可在全基因组水平筛选关键遗传变异，但利用此方法探讨遗传变异与内暴露含量关系的研究较少。因此，可从遗传-环境的角度解释化合物体内含量的差异，有效阐明基因和环境如何改变化学物的体内含量及分布特征及其对人群健康的危害，发现环境影响因素和易感人群，对于全面阐述环境与健康的关系、实施精准预防具有十分重要的意义。
　　研究目的:
　　选择江苏省淮河流域两个典型乡镇开展环境暴露评价和人群流行病学研究，系统探讨环境介质暴露状况、饮食模式、遗传变异对人群POCs内暴露含量的影响，揭示饮食、遗传与内暴露含量的内在联系，为阐明POCs的健康危害、开展风险评估及实施精准防治策略提供理论和实践依据。
　　研究方法:
　　基于课题组前期研究，在相关资料调查与历史资源考察的基础上，结合本研究的研究目的，选择江苏省淮河流域的典型农业乡镇（A区）和典型工业乡镇（B区）作为研究区域。按照我国相关样品采集标准设置采样点，收集水体（水源水和饮用水）、土壤和主要食物（主食、鸡肉、鱼肉、猪肉）;按照多级整群抽样原则，纳入该研究区域内常住人口共计2353例，在签署知情同意书后进行面对面的问卷调查（包括饮食频率调查）和体格检查，并收集血液样本。综合运用固相萃取、圆盘膜萃取和索氏提取等前处理方法和气相色谱/质谱联用仪(GC-MS/MS)，检测水体、土壤、食物和血清样本中10种有机氯农药(OCPs)和14种多氯联苯(PCBs)的含量。
　　采用主成分法分析膳食资料评估膳食模式并进行分类;使用多元线性回归模型评价两地区POCs内暴露水平的影响因素;以POCs内暴露含量为结局，纳入A区511例研究对象开展GWAS筛选，并在两地区人群采用Taqman基因分型法分别验证，通过多元线性回归相加模型确定与代表性POCs内暴露水平相关的遗传变异位点。
　　基于遗传变异位点结果（属于CYP2B6基因变异），开展实验室研究，通过双荧光素酶报告基因实验、WB和酶活性检测实验观察突变后CYP2B6的表达和酶活性变化;采用重组CYP2B6蛋白与p,p'-DDT孵育的体外代谢，观察p,p'-DDT及其代谢产物的变化情况;采用清洁级SD大鼠进行体内代谢实验，使用CYP2B1（与人CYP2B6同源）的特异性抑制剂KR-Ⅱ，观察p,p'-DDT经尾静脉注射后，实验组和对照组中大鼠CYP2B1的活性变化以及不同时间段血清中p,p'-DDT及其代谢产物的变化。
　　最后，基于饮食模式和遗传变异位点分别对p,p'-DDE内暴露水平的结果，采用多元线性回归模型分析饮食模式与遗传变异联合作用的模式和强度，所有P值均为双侧检验(P＜0.05)。
　　结果:
　　1.环境、食品及人群血清中代表性POCs的暴露状况
　　两地区环境中以HCHs和DDTs暴露为主，A区水体中的HCHs、DDTs、PCBs的暴露平均浓度明显低于B区水体中的含量，B区水源水中HCHs的暴露浓度(C水源水=74.14 ng/g)高于末梢水中的浓度（C末梢水=41.49 ng/g），水体中暴露以HCHs为主，其中主要是β-HCH(C水源水=16.60 ng/g);A区土壤中HCHs、DDTs、PCBs的暴露平均浓度(2.94、131.46和17.17 ng/g)明显低于B区土壤中的含量（3.12、81.18和17.68 ng/g）;B区土壤中HCHs显著低于DDTs浓度，土壤中以DDTs污染为主，其浓度高低依次为:p,p'-DDT、p,p'-DDE、o,p'-DDT、p,p'-DDD、o，p'-DDD、o，p'-DDE;环境介质中PCBs的浓度普遍偏低，浓度范围在ND～19.74 ng/g。来源解析结果显示，A区是典型的农业使用区（农业灌溉区以林丹污染为主），B区为为工业来源，过去曾大量生产DDT，这符合两地区的生产特点。
　　与环境介质中暴露浓度趋势相符，B区中食物的暴露浓度普遍高于A区，不同POCs化合物中，DDTs的暴露浓度最高;B区不同食物中，动物性食物中POCs的浓度高于植物性食品中的浓度，DDTs在蔬菜(CDDTs=76.59 ng/g)、面(CDDTs=26.24 ng/g)中的含量明显低于猪肉(CDDTs=110.67 ng/g)、鱼肉(CDDTs=196.78 ng/g)、鸡肉(CDDTs=156.37 ng/g)中的含量;β-HCH、p,p'-DDE和p,p'-DDT是主要的污染物。
　　研究区域的人群的内暴露检测显示，A区β-HCH、p,p'-DDE和PCBs的总浓度（0.79、4.62和10.85μg/g lipid）明显高于B区(0.48、3.87和15.52μg/g lipid);结合检出率、内暴露水平以及单体PCB与总PCBs的相关性，选择p,p'-DDE和PCB126/PCB153作为POCs的代表性化合物。多元回归模型分析影响内暴露的影响因素为年龄、性别、BMI。
　　2.人群饮食模式及其对代表性POCs内暴露水平的影响
　　A区的化合物膳食摄入量EDI(CHCHs=26.66μg/kg.bw.d，CDDTs=24.09μg/kg.bw.d，CPCBs=5.32μg/kg.bw.d)高于B区的摄入(CHCHs=1.93μg/kg.bw.d，CDDTs=2.94μg/kg.bw.d，CPCBs=3.48μg/kg.bw.d)，A、B地区EDIp，p'-DDE估计为0.33和0.22μg/kg.bw.d。两地区在全人群和高暴露人群中EDIp,p'-DDE与内暴露水平呈显著正相关（rA=0.053，rB=0.081，P＜0.05; rA=0.330，rB=0.129，P＜0.05），EDIp,p'-DDE更具代表性，与暴露来源相似，研究人群的内暴露主要源自当地食品。使用三种代表性POCs各种食物的EDI进行主成分分析，获得主食模式、鱼类模式和禽兽肉模式三种饮食模式。多元回归模型分析可知，A地区血清PCB153内暴露含量伴随禽兽模式和鱼类模式饮食得分增加而上升，与低饮食组相比，高饮食组内暴露水平分别增加22.9％和27.2％;B地区血清p,p'-DDE内暴露水平伴随鱼类模式得分的增加而增加，与低鱼类饮食组相比，中度和高度鱼类饮食组人群内暴露含量增加1.2％和4.9％，这符合POCs易蓄积在动物性食品中的观点。
　　3.遗传易感位点筛选及与代表性POCs内暴露水平的关联性
　　以POCs内暴露含量为结局，选取A区511例研究对象开展GWAS筛选，结果显示，位于染色体19q13.2区域的两个SNP与p,p'-DDE内暴露含量的关联达到全基因组显著性水准(P＜1.0×105)，分别为rs2279345（位于CYP2B6基因内含子区，β=-0.311，P=1.78×10-6）和rs3181842(位于CYP2B6基因内含子区3'-UTR区，β=-0.348，P=9.86×10-7)，两个位点高度连锁(r2＞0.99);并在两地区人群进行验证(PA=1.78×10-8，PB=2.98×10-12 for rs2279345; PA=1.19×10-8，PB=2.21×10-12forrs3181842)，两地区总人群中的验证结果更强。未发现与PCB126/PCB153内暴露含量显著相关的位点。
　　CYP2B6基因编码代谢酶CYP2B6，人群研究结果显示，CYP2B6基因位点突变显著降低了p,p'-DDE内暴露水平，初步推测该2个SNP位点的变异可能影响CYP2B6的活性，进而影响化合物的代谢。由于rs2279345和rs3181842高度连锁，且rs3181842的变异位点位于3'-UTR区，故选择rs3181842进行功能研究。体外代谢实验结果显示，CYP2B6可代谢p,p'-DDT为p,p'-DDE，动力学参数Km为15.12μM，Vmax为12.8 nmol/min/nmol P450;双荧光素酶报告基因实验和WB实验表明，rs3181842 C/T位点突变可显著降低CYP2B6的表达水平;大鼠体内代谢实验显示，使用CYP2B1特异性抑制剂（基于rs3181842 T突变导致的酶活性下降）可导致CYP2B1为代谢酶活性显著下降，大鼠血清中原形p,p'-DDT的残留较多、代谢产物p,p'-DDE的生成物显著减少。
　　4.CYP2B6基因变异和饮食模式对人群p,p'DDE内暴露水平的联合效应
　　rs2279345和rs3181842不同基因型和不同饮食模式下分布并无统计学差异(P＞0.05);两地区人群在相同饮食模式下，在rs2279345和rs3181842各自不同基因型下（分别为TT/CT/CC; CC/CT/TT）p,p'-DDE内暴露水平显著下降(P＜0.001);B地区人群在rs3181842 CT/TT基因型下，p,p'-DDE内暴露水平随着鱼类模式得分的增加而增加(CT: CT1=3.36 ng/g，CT2=3.50 ng/g，CT3=4.02 ng/g; TT: CT1=3.07 ng/g，CT2=3.34 ng/g，CT3=5.48 ng/g)，且具有显著性差异(P=0.046，P=0.038)。
　　使用多元线性回归模型分析饮食模式和遗传变异对p,p'-DDE内暴露水平的联合效应，可见工业污染源B地区中rs3181842与各膳食模式的模型可解释度R2达25.4％～37.0％，rs3181842突变基因可显著降低内暴露含量19.95％，而高得分鱼类模式显著增加内暴露含量7.68％，rs3181842与鱼类模式存在联合效应降低内暴露含量15.8％，且具有统计学差异(P＜0.001)。
　　结论:
　　与两地污染源特点一致（A区为农业源污染，B区为工业源污染），B区环境介质中POCs的浓度高于A区，水体中以HCHs暴露为主，其中主要是β-HCH;土壤中以DDTs污染为主，其浓度高低依次为:p,p'-DDT、p,p'-DDE、o，p'-DDT、p,p'-DDD、o，p'-DDD、o,p'-DDE。与环境介质中暴露浓度趋势相符，B区中食物的暴露浓度普遍高于A区，不同POCs化合物中，DDTs的暴露浓度最高;由于A区膳食消费量高于B区，A区人群的化合物膳食摄入量以及内暴露水平均高于B区。p,p'-DDE和PCB126/PCB153是人群POCs内暴露的代表性化合物，使用化合物的各种膳食的摄入量进行主成分分析，获得主食模式、鱼类模式和禽兽肉模式，两地区人群血清PCB153、p,p'-DDE内暴露含量伴随禽兽模式和鱼类模式饮食得分增加而上升，这与POCs蓄积在动物性食品的结果相一致。CYP2B6基因上的SNP rs2279345和rs3181842是影响p,p'-DDE内暴露含量的重要遗传变异位点，突变位点突变可将大大降低p,p'-DDE内暴露水平。仅在工业源污染的B区发现rs3181842与鱼类模式存在联合效应，遗传变异位点的作用更大。
　　综上，研究提示工业源污染的环境介质中POCs内暴露水平更高，但饮食食物消费量可显著影响内暴露水平，rs3181842对p,p'-DDE内暴露水平具有重要作用，鱼类模式可增加化合物蓄积，但作用强度小于遗传变异。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

结果一 环境、食品及人群血清中代表性PoCs的暴露状况

结果二 人群饮食模式及其对代表性POCs内暴露水平的影响

结果三 遗传易感位点筛选及与代表性POCs内暴露水平的关联性

结果四 CYP2B66基因变异和饮食模式对人群p，p’-DDE内暴露水平的联合效应

讨论

结论与展望

参考文献

文献综述：现代暴露评估技术及相关资源的研究进展

附录

攻读学位期间的研究成果

致谢