CEP55在神经胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞功能的影响

摘要

背景:神经胶质瘤作为目前颅内神经系统发病率最高的原发性肿瘤，一直被全世界研究人员所重视。目前针对神经胶质瘤的治疗依然主要为手术切除、放射治疗及化学治疗，而由于其恶性程度较高，大部分患者的预后情况不够乐观。虽然大量的研究显示，神经胶质瘤的发生发展与其蛋白质表达改变有较强的相关性，但并未从根本上解决神经胶质瘤发生及恶化的机制。因此，探讨神经胶质瘤蛋白调节机制，则显得尤为重要。
　　CEP55(55kD)为中心体相关蛋白55，与细胞周期的中心体和中间体偶联，经磷酸化后可发挥调控细胞周期的作用。而沉默CEP55基因表达，可出现多核细胞以及中期纺锤体数量异常，使细胞分裂停滞于中间体阶段，并导致胞质分裂失败。这些现象都证明了CEP55在纺锤体装配、极化、分离及胞质分裂中有着重要的调控作用。CEP55首次于2005年被发现，在随后的研究中可见，CEP55在胃癌、乳腺癌及膀胱癌中都有着较高的表达量。而在胶质瘤中却鲜有报道，尤其是CEP55与肿瘤的侵袭、迁移功能方面尚无文献描述。
　　目的:CEP55蛋白在多种肿瘤中都有着较高的表达量，并对细胞周期有着重要的调控作用。因此，本实验在组织水平和细胞水平上研究神经胶质瘤中CEP55的表达，同时，探索其对神经胶质瘤细胞功能及细胞凋亡的影响。
　　方法:
　　(1)收集南京医科大学附属南京脑科医院手术切除的新鲜神经胶质瘤组织标本25例。并收集抢救重度颅脑外伤切除的膨出脑组织标本10例作为正常对照组，将其视为正常组织。
　　(2)从基因水平及蛋白质水平等方面检测35例样本中CEP55的表达情况差异。并分析CEP55表达差异的趋势，及其与胶质瘤级别或患者生存期之间的关系。
　　(3)通过siRNA及慢病毒感染，敲低神经胶质瘤LN229细胞系中CEP55的表达量，并采用细胞计数、划痕、Transwell实验及流式细胞技术等方法检测其对细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡能力的影响。
　　结果:
　　(1) CEP55蛋白在神经胶质瘤标本中表达量较正常对照组明显增高，且不同等级的神经胶质瘤组织中，CEP55蛋白表达量不同，呈逐渐增高的趋势。而在神经胶质瘤组织中CEP55基因表达同样高于正常对照组。并且，在低级别胶质瘤中，CEP55表达量与患者生存期也存在较强的相关性。
　　(2)在神经胶质瘤细胞中，通过RNAi手段可以干扰CEP55基因的表达量，同时使其蛋白表达量也下降。通过慢病毒包装siRNA片段并转染神经胶质瘤细胞LN229，可以有效地构建CEP55稳定敲低细胞系。
　　(3)通过细胞计数实验，可发现敲低CEP55表达的细胞较正常细胞增长明显减缓。通过划痕实验，可观察到敲低CEP55表达的细胞，其迁移能力也明显降低。通过Transwell实验，可发现其侵袭能力同样也随CEP55表达降低而降低。而通过流式细胞技术检测，可发现CEP55表达量降低可导致LN229细胞凋亡增加。
　　结论:通过研究发现在神经胶质瘤组织中，CEP55的基因及蛋白表达量较正常对照组明显增高，且蛋白表达与肿瘤WHO分级相关。同时，CEP55表达量在低级别神经胶质瘤中，还与患者生存期相关。随后，通过siRNA及慢病毒干扰CEP55表达后可影响神经胶质瘤细胞LN229的增殖、迁移及侵袭功能，并增加细胞凋亡。由于CEP55蛋白参与细胞胞质分裂的调控，并可能通过其功能引起肿瘤细胞增殖增加，细胞功能增强。这使得CEP55可能成为神经胶质瘤分子治疗的新的靶点，发挥抑制肿瘤甚至消除肿瘤的效果。

目录

声明

摘要

前言

1、材料

1．1 神经胶质瘤组织及细胞系来源

1．2 实验原始数据来源

1．3 实验仪器

1．4 实验试剂及耗材

1．5 引物设计及序列、siRNA序列

2、实验方法

2．1 实时荧光定量PCR

2．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Western Blot)

2．3 细胞培养

2．4 免疫组织化学染色

2．5 患者生存曲线绘制

2．6 siRNA转染步骤

2．7 慢病毒转染步骤

2．8 细胞划痕实验步骤

2．9 细胞侵袭实验步骤

2．10 流式细胞技术检测细胞凋亡水平

2．11 统计方法

3、结果

3．1、CEP55在神经胶质瘤组织中呈高表达

3．2、CEP55高表达对神经胶质瘤患者生存期产生影响

3．3、CEP55蛋白在不同细胞系中的表达

3．4、siRNA干扰CEP55基因表达细胞系的构建

3．5、CEP55基因稳定干扰细胞系构建

3．6、CEP55影响细胞增殖

3．7、CEP55影响细胞迁移能力

3．8、CEP55影响细胞侵袭能力

3．9、CEP55表达降低促进细胞凋亡

4、讨论

5、结论

参考文献

综述 CEP55蛋白功能及其与肿瘤相关性的研究进展

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢