PNPLA3基因I148M多态性在非酒精性脂肪性肝纤维化中的机制研究

摘要

目的:在动物和细胞水平上探究PNPLA3 I148M基因多态性对Hedgehog(Hh)信号通路表达的影响，从而揭示PNPLA3 I148M基因多态性在非酒精性脂肪性肝纤维化中作用机制。
　　方法:采用显微注射法构建了野生型纯合子(pNpLA3+/+)、杂合子(PNPLA3148M/+)、突变型纯合子(PNPLA3148M/M)三种转基因小鼠模型，在相同环境下，采用正常饮食、饮水饲养16周后，将小鼠在乙醚麻醉后迅速解剖，从心脏采取血液标本，检测血清中的TG、TC、ALT、AST的水平，获取小鼠新鲜的肝脏组织标本，采用荧光定量PCR的检测Hh信号通路基因以及与细胞增殖凋亡相关基因的表达，采用western blot在蛋白水平上对上述基因的表达进行验证。在细胞实验方面，运用双酶切的方法合成PNPLA3 I148M野生型及突变型的基因序列和慢病毒载体序列，将目的基因序列和载体序列进行连接，合成携带目的基因的载体质粒并对其纯化扩增及转染293T细胞，从而获得高滴度携带PNPLA3不同基因型的慢病毒;采用慢病毒转染的方法转染HSC-T6细胞，利用嘌呤霉素对转染的HSC-T6细胞株进行筛选，构建能够稳定表达PNPLA3 I148M野生型和突变型基因细胞系，在此基础上，分别检测过表达PNPLA3 I148M野生型和突变型基因的HSC-T6细胞内Hh信号通路及与细胞增殖凋亡相关基因的表达情况，并采用Western blot进行蛋白水平上的验证。定量资料以“均数±标准差”进行表述，采用独立样本t检验对定量资料进行统计学分析;检验标准设定为P＜0.05。
　　结果:(1)与PNPLA3+/+小鼠相比，PNPLA3148M/M小鼠血清中ALT水平高于PNPLA3+/+小鼠，结果有统计学意义。(2)与PNPLA3+/+小鼠相比，PNPLA3148M/+和PNPLA3148M/M小鼠肝脏组织内shh、patched、smo、gli-1等基因的表达明显上调，差异具有统计学意义。(3)与PNPLA3+/+小鼠相比，我们发现PNPLA3148M/+和PNPLA3148M/M小鼠肝脏组织内bcl-2，PDGF和TGFβ1等基因的表达明显增高，差异具有统计学意义。(4)成功组装了携带PNPLA3 I148M野生型和突变型基因的慢病毒，并成功感染了HSC-T6细胞，采用倒置荧光显微镜观察，绿色荧光阳性率达到85％，采用嘌呤霉素筛选后，阳性率达到95％以上。采用Western blot验证野生型组和突变型组细胞内PNPLA3蛋白较空载体对照组细胞表达增加，证实过表达PNPLA3 I148M野生型和突变型基因的HSC-T6细胞株构建成功。(5)PNPLA3 I148M突变基因过表达的HSC-T6细胞系内shh、patched、smo、gli-1等基因的相对表达量明显高于野生型细胞组，差异具有统计学意义。(6)与PNPLA3 I148M野生型细胞相比，突变型细胞内bcl-2，PDGF和TGFβ1表达明显上调，差异具有统计学意义。
　　结论:PNPLA3 I148M基因突变可能通过促进Hh信号通路的激活，引起肝星状细胞的增殖和活化，在非酒精性脂肪性肝纤维化的发生中发挥着重要的作用。

目录

声明

摘要

前言

第1章 PNPLA3多态性对小鼠肝脏内Hh通路的影响

1．1 实验材料

1．2 实验方法

第2章 稳定表达PNPLA3基因的HSC-T6细胞系的构建

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第3章 PNPLA3多态性对HSC-T6细胞内Hh通路的影响

3．1 实验材料

3．2 实验方法

第4章 结果

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

综述 Hedgehog信号通路与慢性肝病的研究进展

缩略词

攻读学位期间发表文章情况

致谢