孤独症易感基因neuroligin3在转录调控中的机制研究

摘要

神经系统的异常发育会导致神经发育相关的疾病，如孤独症。其中，突触黏附分子在神经细胞的分化发育中起着十分重要的作用。Neuroligin3不仅是突触前、后膜均有分布的跨膜蛋白，而且也是孤独症的易感基因。最近的研究发现，Neuroligin3在突触的成熟和NMJ的分化发育中起着重要的作用，但其作用机制并不清楚。本实验室以果蝇为模式生物，用高通量测序和生物化学的方法对其进行研究，探讨果蝇Neuroligin3分子在神经发育中的作用机制。
　　果蝇Neuroligin3与脊椎动物Neuroligin高度同源，共编码1158个氨基酸。我们实验室之前的研究表明Neuroligin3胞内段存在和细胞核共定位的现象，虽然这种共定位现象的生理意义并不明确，但基于目前研究的提示:即孤独症患者大脑皮层中存在大量基因的差异表达。由此我们推测，Neuroligin3通过影响基因的表达参与神经系统发育的调控。
　　为了探索Neuroligin3通过影响基因的表达参与神经系统发育调控的假说，首先通过在果蝇细胞S2中过表达Neuroligin3的胞内段，细胞免疫荧光染色和western blot分析均显示，胞内段和细胞核有共定位，以及在胞浆蛋白中检测到了flag信号，说明Neuroligin3有参与基因表达调控的可能;其次，运用高通量测序RNA-seq对野生型果蝇(W1118)和neuroligin3突变果蝇的头部进行转录组测序，结果显示，neuroligin3的突变会导致大量基因的差异表达，说明Neuroligin3参与基因的表达调控;随后利用GO分析，发现下调的基因中存在各个系统发育相关的基因。
　　综上所述，本研究工作完善了实验室之前的工作，通过过表达Neuroligin3的胞内段，验证Neuroligin3参与基因表达调控的可能;转录组测序再一次从分子层面验证了Neuroligin3参与神经系统基因的表达调控，一旦neuroligin3突变，会导致神经系统的基因异常表达，而且这些异常表达的基因会严重影响神经系统的分化发育。本工作为进一步揭示Neuroligin3在神经系统的发育分化中的机制研究提供了新的见解和方向，这些结果也进一步反映了突触黏附分子在神经系统发育分化和疾病中的重要作用。

目录

声明

摘要

绪论

第一章 文献综述

1．1 Neuroligin分子简介

1．1．1 Neuroligin家族

1．1．2 Neuroligin分子与神经发育

1．1．3 Neuroligin分子与疾病

1．1．4 Neuroligin分子的切割现象

1．2 膜上分子切割介导的信号转导

1．2．1 跨膜蛋白与信号转导

1．2．2 跨膜蛋白的切割与生物学效应

1．3 高通量测序技术

1．3．1 高通量测序技术简介

1．3．2 RNA-Seq的原理与应用

1．3．3 RNA-Seq的数据分析

第二章 实验材料及方法

2．1 实验材料及方法

2．1．1 果蝇品系

2．1．2 宿主菌及细胞系

2．1．3 培养基

2．1．4 所使用试剂及缓冲液

2．1．5 主要仪器及耗材

2．1．6 抗体及引物

2．1．7 差异基因定量分析及可视化软件

2．1．8 差异基因GO分析及Pathway分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 重组质粒的构建、转化及提取

2．2．2 果蝇S2细胞培养及瞬时转染

2．2．3 细胞免疫荧光染色、Western Blot免疫印迹

2．2．4 果蝇头部基因组、总RNA的提取质检及cDNA的合成

2．2．5 基因的定量分析及差异基因的筛选

2．2．6 差异基因的功能分析

第三章 结果与讨论

3．1 引言

3．2 过表达的Nl3-ICD入核

3．2．1 前言

3．2．2 Nl3-ICD在果蝇S2细胞中的入核

3．2．3 讨论

3．3 Nl3突变体果蝇的头部存在大量基因的差异表达

3．3．1 前言

3．3．2 Nl3突变体果蝇的头部差异基因的表达分析

3．3．3 讨论

3．4 大量基因的差异表达富集于发育及发育调控相关生物学过程

3．4．1 前言

3．4．2 大量基因的差异表达富集于发育及发育调控相关生物学过程

3．4．3 讨论

3．5 总结与展望

参考文献

作者简介

致谢