肾型谷氨酰胺酶调控肝癌上皮间质转化分子机制研究

摘要

目的：通过体外、体内实验及临床验证，研究肾型谷氨酰胺酶在肝细胞性肝癌发生上皮向间质转化过程中的作用及其机制。 方法：人肝细胞癌LM3细胞株通过慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro GLS1过表达肾型谷氨酰胺酶（GLS1）或通过慢病毒载体LV-GLS-sgRNA敲减GLS1构建GLS1不同表达的稳转株。通过Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力。通过细胞划痕实验检测细胞融合速度。通过蛋白质印迹实验检测谷氨酰胺酵解及上皮间质转化相关蛋白的表达水平。ELISA法检测了基质金属蛋白酶MMP2及MMP9的表达。通过不同GLS1表达水平（GLS1过表达组，GLS1敲减组和对照组）的HCCLM3细胞株建立裸鼠皮下种植瘤模型评估GLS1的表达水平对HCCLM3细胞株成瘤情况，并通过裸鼠肝脏原位成瘤模型评估肝内转移及肺转移的情况。还通过石蜡切片免疫组化实验检测了肝癌组织及癌旁组织中GLS1及EMT相关蛋白的表达，评估其相关性。通过GLS1的表达与微血管侵犯的关系以及对肝癌预后的影响进行了临床验证。 结果：HCCLM3过表达及敲减GLS1稳转株成功建立。Transwell实验显示，与对照组比较，GLS1过表达组细胞迁移及侵袭能力增强，而GLS1敲减组细胞迁移及侵袭能力减弱。细胞划痕实验显示，与对照组比较，GLS1过表达组细胞融合速度增快，而GLS1敲减组细胞融合速度减慢。蛋白质印迹实验显示，与对照组比较，GLS1过表达组细胞E-cadherin（上皮表型标记）表达量下调，而Vimentin（间质表型的标记）表达量上调，同时负调控E-cadherin的转录因子ZEB1显著上调，提示HCCLM3细胞株上皮间质转化水平上调。GLS1敲减组细胞E-cadherin（上皮表型标记）表达量上调，而Vimentin（间质表型的标记）表达量下调，同时负调控E-cadherin的转录因子ZEB1显著下调，提示HCCLM3细胞株上皮间质转化水平下调。ELISA实验显示GLS1过表达组MMP2及MMP9蛋白随着时间延长而表达量增加。体内实验提示与对照组相比，GLS1敲减组皮下种植瘤成瘤率低，成瘤体积小，而过表达组与对照组比较成瘤率及成瘤大小均无明显差异。随着GLS1表达下调，E-cadherin的表达量增加而Vimentin的表达量减少。而调控EMT信号通路的关键因子Slug和ZEB1均上调。GLS1过表达组小鼠血MMP2高于GLS1敲减组。GLS1敲减组肝脏原位成瘤实验，提示肺转移率低，与过表达组及对照组比较差异显著。临床标本石蜡切片免疫组化实验提示肝癌组织中不同GLS1表达水平与EMT相关的基因，如Vimentin、Snail、ZEB1、ZO1等的表达有一定的相关性。同时GlS1表达水平与肿瘤微血管侵犯及肝癌患者预后具有相关性。 结论：抑制谷氨酰胺代谢能够作为肝癌治疗尤其是控制其进展的有效策略，并且GLS1可能是人肝细胞性肝癌治疗的潜在靶点。

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