G蛋白信号调控蛋白12在心肌肥厚中的作用及机制研究

摘要

目的:
　　心肌肥厚是一个多分子、多信号通路参与的复杂病理生理过程，可能导致心力衰竭、猝死等严重心血管事件，但是目前对于心肌肥厚发生发展的分子机制的认识仍十分有限。G蛋白信号通路调节蛋白(RGS)家族多个成员被发现参与心肌肥厚的病理生理过程。RGS12是分子量最大、功能结构域最多的RGS家族成员。结构的复杂性决定了RGS12可以发挥更复杂和更精密的分子调控作用。本研究旨在阐明RGS12对心肌肥厚的影响及其具体机制。
　　方法:
　　第一部分:选取野生型(WT)小鼠及Sprague-Dawley大鼠乳鼠心肌细胞作为研究对象，分别采用胸主动脉缩窄术(AB)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理建立在体心肌肥厚和离体心肌细胞肥大模型，运用Western blot检测造模后各时间点心肌组织、心肌细胞和成纤维细胞内RGS12表达水平。
　　第二部分:选取全系统RGS12基因敲除(RGS12-KO)小鼠和WT小鼠作为研究对象，采用AB构建心肌肥厚模型。手术4周后检测相关指标:取材小鼠心脏、肺脏和左侧胫骨，计算心体比(HW/BW)、心胫比(HW/TL)和肺体比(LW/BW);采用H&E、WGA、PSR等病理染色评价心肌细胞横截面积及胶原沉积水平;超声成像仪检测小鼠心脏功能;应用实时定量PCR检测心肌肥厚和纤维化标志物水平。
　　第三部分:选取心脏特异性RGS12转基因（RGS12-CTG）小鼠和CAG-(loxP)CAT(loxP)-RGS12/α-MHC-MerCreMer双转基因(CRMC)小鼠作为研究对象，采用AB构建心肌肥厚模型。手术4周后检测相关指标:取材小鼠心脏、肺脏和左侧胫骨，计算HW/BW、HW/TL和LW/BW;采用H&E、WGA、PSR等病理染色评价心肌细胞横截面积及胶原沉积水平;超声成像仪检测小鼠心脏功能;应用实时定量PCR检测心肌肥厚和纤维化标志物水平。
　　第四部分:利用腺病毒转染手段，构建RGS12低表达(AdshRGS12)或高表达(AdRGS12)乳鼠心肌细胞，以腺病毒载体AdshRNA和AdGFP转染乳鼠心肌细胞作为相应的对照组，分别运用AngⅡ和内皮素(ET-1)构建离体心肌细胞肥大模型。促肥厚因子干预48小时后检测相关指标:采用免疫荧光染色比较测量心肌细胞表面积;应用实时定量PCR检测心肌肥厚标志物水平。
　　第五部分:分别在动物实验和细胞实验中，运用Western blot检测各组小鼠心脏组织或心肌细胞中MAPK信号通路分子的总量和磷酸化水平变化。然后，以Sprague-Dawley大鼠乳鼠心肌细胞为研究对象，采用AngⅡ干预构建离体心肌细胞肥大模型，运用免疫共沉淀检测RGS12与信号通路关键分子的相互作用。最后，以RGS12-TG和CRMC小鼠作为研究对象，采用AB构建心肌肥厚模型，使用信号通路分子特异性抑制干预小鼠。手术4周后检测相关指标:取材小鼠心脏、肺脏和左侧胫骨，计算HW/BW、HW/TL和LW/BW;采用H&E、WGA、PSR等病理染色评价心肌细胞横截面积及心肌纤维化程度;超声成像仪检测小鼠心脏功能。
　　结果:
　　第一部分:在体心肌肥厚模型和离体心肌细胞肥大模型中，心肌肥厚标志物表达水平明显升高。与假手术组(Sham)相比，AB组小鼠心肌组织内RGS12蛋白表达量明显提高，且手术8周后的表达水平高于手术4周后。与在体实验类似，AngⅡ干预24小时和48小时后，心肌细胞内RGS12的蛋白质水平逐渐升高。然而，AngⅡ干预后，成纤维细胞内RGS12蛋白水平无明显变化。
　　第二部分:WT和RGS12-KO小鼠行假手术造模后，两组小鼠的心脏大小、纤维化程度、心脏功能及相关基因表达水平无明显差异。AB构建心肌肥厚模型4周后，取材结果发现，RGS12-KO小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW小于WT小鼠;病理染色结果发现，RGS12-KO小鼠的心脏大小、心肌细胞横截面积、间质和血管周围胶原沉积以及胶原容积低于WT小鼠;心脏超声结果发现，RGS12-KO小鼠的左心腔扩大和左心收缩功能减低程度好于WT小鼠;RT-PCR检测结果发现，RGS12-KO小鼠的心肌肥厚标志物的mRNA表达水平低于WT小鼠。
　　第三部分:CRMC和RGS12-CTG小鼠行假手术造模后，两组小鼠的心脏大小、纤维化程度、心脏功能及相关基因表达水平无明显差异。AB构建心肌肥厚模型4周后，取材结果发现，RGS12-CTG小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW高于CRMC小鼠;病理染色结果发现，RGS12-CTG小鼠的心脏大小、心肌细胞横截面积、间质和血管周围胶原沉积以及胶原容积大于CRMC小鼠;心脏超声结果发现，RGS12-CTG小鼠的左心腔扩大和左心收缩功能减低程度较CRMC小鼠加重;RT-PCR检测结果发现，RGS12-CTG小鼠的心肌肥厚标志物的mRNA表达水平高于CRMC小鼠。
　　第四部分:PBS干预AdshRGS12、AdshRNA、AdRGS12和AdGFP组乳鼠心肌细胞48小时后，各组乳鼠心肌细胞表面积和相关基因表达水平无明显差异。AngⅡ干预48小时后，免疫荧光染色结果发现，AdshRGS12组心肌细胞表面积小于AdshRNA组，而AdRGS12组心肌细胞表面积大于AdGFP组;RT-PCR检测结果发现，AdshRGS12组心肌肥厚标志物的mRNA表达水平低于AdshRNA组，而AdRGS12组心肌肥厚标志物mRNA的表达水平高于AdGFP组。
　　第五部分:促肥厚刺激不影响丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路分子的蛋白质总量，却引起MAPK信号通路分子的磷酸化程度升高。其中，JNK1/2和P38的磷酸化程度不受RGS12表达水平的影响，而RGS12高表达提高MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，RGS12低表达降低MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平。同时，AngⅡ干预后，RGS12能够在心肌细胞内与MEK1/2结合形成功能复合体。在RGS-CTG和CRMC小鼠心肌肥厚模型中，MEK1/2特异性抑制剂(U0126)干预能够显著降低小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW，改善小鼠心肌肥厚、心肌细胞横截面积增大、间质和血管周围胶原沉积，缓解左心腔扩大和左心收缩功能减低。更为重要的是，这些心脏肥厚性重构指标在RGS-CTG/U0126和CRMC/U0126小鼠之间无明显统计学差异。
　　结论:
　　本研究结果表明促肥厚刺激诱导心肌细胞内RGS12表达升高，高表达的RGS12与MEK1/2形成功能复合体，促进MEK1/2-ERK1/2信号通路激活，促进压力负荷诱导的心肌肥厚发生发展。因此，RGS12具有成为临床治疗心肌肥厚新靶点的潜力。

目录

声明

摘要

主要缩略词表(ABBRE3VIATION)

绪论

参考文献

文献综述 G蛋白信号调控蛋白家族在心血管系统中的作用

第一部分 RGs12在心肌肥厚病理生理过程中的表达变化

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第二部分 全系统RGs12基因敲除对压力诱导心肌肥厚反应的影响

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第三部分 心脏特异性RGs12转基因对压力诱导心肌肥厚反应的影响

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第四部分 RGs12分子对体外心肌细胞肥大反应的影响

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第五部分 RGs12调控心肌肥厚病理生理过程的分子机制

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

参考文献

结论

致谢

作者简介

攻读学位期间成果