微囊泡在介导急性中长波紫外线辐射“旁观者效应”中的作用

摘要

日光中紫外线所致的皮肤光损伤疾病一直是人们关注的一类热点疾病。研究表明，紫外线除了引起受辐射细胞的直接损伤外，还可以通过紫外线辐射旁效应（Ultraviolet irradiation induced bystander effects，UV-BE）引起临近细胞的间接损伤。近年来，有关紫外线辐射旁效应的研究，已经覆盖体内外多种光损伤模型。研究者发现不同波段的紫外线均可产生多种旁观者效应。此外，不同剂量紫外线也可诱导不同强度的旁观者效应。种种证据表明，紫外线辐射旁效应可能在加剧皮肤光损伤和光致癌等重要病理过程中发挥重要作用。既往旁效应的研究主要集中于离子辐射，尽管紫外线作为一种非离子射线，其诱发旁效应的证据已经建立得很充分，而这一机制发生的生化、分子机制研究目前却刚刚起步，这一方面的研究已经得到众多学者的关注。
　　近年来，微囊泡(microvesicles，MVs)的功能和其携带的信息物质是生物学研究一大热点。研究报道受到离子辐射的细胞可向外分泌微囊泡，它是细胞出芽与细胞膜融合后直接脱落形成的囊性结构，并携带蛋白质、mRNA、miRNA和DNA，参与细胞间的信息传递，介导旁效应的产生。
　　目的：
　　观察急性中长波紫外线辐射诱导皮肤成纤维细胞微囊泡的生成及其对人皮肤成纤维细胞形态，增殖活性，氧化损伤及凋亡的影响。
　　方法：
　　1.中长波紫外线辐射诱导皮肤成纤维细胞微囊泡的生成及鉴定
　　分别采用不同剂量中长波紫外线(Ultraviolet A/Ultraviolet B，UVA/UVB)辐射人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblasts，HSF），建立急性光损伤细胞模型。本研究中采用的UVA辐射剂量为10J/cm2和20J/cm2; UVB辐射剂量为30mJ/cm2和60mJ/cm2。用特别配置的无微囊泡(microvesicles，MVs)培养基孵育HSF，经上述剂量UVA和UVB辐射细胞后，于照射后0.5h、24h、48h、72h分离提取细胞上清液中的MVs。随后使用透射电镜及光散射分析技术检测所获得的MVs大小及含量，BCA蛋白定量法测定各组细胞上清中MVs蛋白的含量，蛋白质免疫印迹法(Western blotting，WB)检测MVs表面蛋白。
　　2.急性中长波紫外线辐射诱导生成的微囊泡对人皮肤成纤维细胞形态、增殖活性、氧化损害及凋亡的影响
　　采用UVA(20J/cm2)及UVB(60mJ/cm2)对HSF进行急性辐射，收集培养24h后上清液中的MVs。将上述收集的MVs用PKH26染料标记后与正常HSF共孵育，观察HSF对MVs的摄取情况;倒置显微镜下观察旁观者细胞形态，细胞计数CCK-8法及EDU染色法检测旁观者细胞增殖率。ROS检测试剂盒检测旁观者细胞的氧化损伤，使用线粒体膜电位检测试剂盒检测旁观者细胞的早期凋亡，膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)/碘化丙啶(PI)双染法流式细胞仪检测旁观者细胞的凋亡率。
　　结果：
　　1.中长波紫外线辐射诱导人皮肤成纤维细胞微囊泡的生成及鉴定
　　中长波紫外线辐射诱导生成的MVs明显高于正常成纤维细胞的释放量。透射电镜结果示MVs是一种膜性微囊结构，圆形或椭圆形，有完整的包膜，腔内为低电子密度成分;光散射分析技术提示紫外线辐射后诱导生成的MVs的直径多聚集在150-300nm，而正常HSF分泌的MVs直径多在120-200nm，且辐射后HSF分泌的MVs高于正常HSF所分泌的数量;BCA蛋白定量结果示，紫外线辐射后HSF上清液中MVs在辐射后24h-48h间有一个分泌高峰，而正常细胞在不同时间点分泌MVs的数量相对恒定;WB结果提示紫外线辐射组诱导生成的MVs，其表面蛋白Alix、tsg101及CD9表达阳性，显著表达Alix。
　　2急性中长波紫外线辐射诱导生成的微囊泡对人皮肤成纤维细胞形态、增殖活性、氧化损害及凋亡的影响
　　PKH26荧光标记的MVs在加入培养基30min后即可被旁观者HSF摄取，在共孵育的48h内，细胞核周边聚集的MVs逐渐增多。紫外线辐射诱导生成的MVs较正常HSF分泌的MVs被旁观者细胞摄取速度更快。旁观者细胞与紫外线辐射诱导生成的MVs共孵育后，倒置显微镜下观察出现较多的细胞碎片，细胞体积变大，过度伸展;CCK-8结果提示旁观者HSF增殖减缓;EDU染色法提示出现旁观者细胞周期阻滞，S期细胞增多;ROS结果提示，旁观者细胞活性氧荧光强度高于未辐射组;线粒体膜电位结果提示旁观者HSF表现为出现较多的细胞碎片，并出现较多绿色荧光，表明细胞出现早期凋亡;AV/PI双染法结果提示旁观者HSF表现出凋亡率升高;而细胞的氧化损害和凋亡率在加入抗氧化剂NAC后，上述旁观者效应能够被部分逆转。
　　结论：
　　急性中长波紫外线辐射可诱导人皮肤成纤维细胞释放微囊泡，微囊泡能够被旁观者成纤维细胞所摄取，导致后者出现细胞形态变化，细胞增殖减缓，细胞周期阻滞，出现细胞氧化损伤和凋亡。

目录

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全文技术流程图

全文主要缩略语

摘要

前言

材料与方法

1．材料

2．HSF分离及培养

3．无MVs血清及条件培养基制备

4． 中长波紫外线急性损伤细胞模型建立

5．培养基中MVs的分离收集

6．实验分组

7．MVs鉴定及蛋白含量测定

8．Western印迹

9．倒置显微镜观察细胞形态

10．CCK-8法检测细胞增殖活性

11．EDU法检测细胞增殖

12．细胞对MVs摄取的动态观察

13．荧光酶标仪检测荧光值

14．活性氧检测

15．细胞凋亡的检测

16．统计方法

结果

1．不同剂量UVA／UVB辐射过后的HSF在不同时间释放的MVs蛋白含量变化

2．紫外线辐射后HSF释放的MVs的形态

3．UVA／UVB辐射后HSF分泌的MVs含量变化及大小分布范围

4．60mJ／cm2 UVB组MVs蛋白Alix，tsg101及CD9的表达

5．紫外线辐射诱导生成的MVs对成纤维细胞形态的影响

6．紫外线辐射诱导生成的MVs对成纤维细胞增殖活性的影响

7．HSF摄取MVs的观察

8．细胞内活性氧含量变化

9．细胞凋亡的检测

讨论

参考文献

综述 紫外线辐射的旁观者效应研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢