MALAT1-SP1转录反馈环路在肺癌中的作用机制研究

摘要

目的:肺腺癌转移相关转录本(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1)是细胞核核斑区的一种长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，全长约8kb，不编码蛋白质。MALAT1在多种肿瘤中过表达，是一种被广泛认可的肿瘤诊断、分期、预后的生物标志物。到目前为止，很多文献均报道了MALAT1对很多肿瘤细胞的迁移和侵袭能力有着非常重要的作用。但MALAT1在肿瘤中的具体作用途径仍然不详。本实验室在前期的MALAT1基因的转录调控工作中，首次发现SP1(Specificprotein1)在肺癌中是调控MALAT1基因转录的重要转录因子(Transcription factor，TF)，并且下调SP1会抑制MALAT1的表达，进而抑制肿瘤。在实验室前期的研究基础上，通过PCR和western blot实验发现过表达MALAT1，SP1的表达量升高。因此，在肺癌细胞中，SP1蛋白与MALAT1之间形成了一个转录反馈环路。为了阐明MALAT1-SP1转录反馈环路在肺癌中的作用机制。本论文将以两种肺癌细胞系为模型展开实验，对以下3个问题进行更进一步研究:1.MALAT1如何促进SP1表达量升高？2.反馈环路是如何影响肺癌的生长转移？3.反馈环路对临床治疗有何意义？
　　方法:(1)研究肺癌细胞中上调或下调MALAT1的表达量对SP1表达量的影响:在肺癌细胞中过表达或干扰MALAT1，并提取细胞总RNA和总蛋白，通过RT-PCR和westernblot从RNA水平和蛋白水平直接检测SP1的表达量，并运用同样的方法检测过表达或者干扰MALAT1的肺癌细胞中SP1下游靶基因的表达量。SP1下游靶基因表达量的检测可以间接地反映MALAT1的表达量对SP1表达量的影响。
　　(2)研究肺癌细胞中MALAT1转录产物RNA调节SP1表达量的作用方式:由于SP1是自身的转录因子，通过细胞免疫荧光实验探究MALAT1是否可以促进SP1蛋白入核，从而影响SP1自身的转录;通过免疫共沉淀和紫外交联实验探究MALAT1-RNA是否通过结合SP1蛋白对SP1蛋白起到了保护作用，通过半衰期实验进一步探究MALAT1的表达量对SP1蛋白稳定性的影响。
　　(3)研究MALAT1的表达对肺癌细胞体外转移能力以及对体内肿瘤生长速率的影响:siRNA干扰肺癌细胞中MALAT1的表达，通过wound healing实验和transwell实验探究MALAT1的表达量对肺癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。在裸鼠皮下注射肺癌细胞，在长出的肿瘤中通过siRNA干扰MALAT1的表达，并测量肿瘤的大小，作出肿瘤生长曲线，探究MALAT1的表达量对体内肿瘤生长速率的影响。
　　(4)研究临床肺组织中MALAT1与SP1的相关性:从正常人和肺癌病人的肺组织临床标本中提取RNA和蛋白，通过RT-PCR和western blot验证MALAT1和SP1的相关性。
　　结果:通过RT-PCR和western blot实验发现在肺癌细胞中过表达MALAT1的1905-3235区域的RNA片段能够促进SP1以及SP1下游靶基因的表达。通过免疫荧光实验，发现在肺癌细胞中过表达MALAT1，细胞质和细胞核中的SP1均升高。随后通过检测SP1半衰期实验，发现过表达MALAT1可以延长SP1的半衰期。免疫共沉淀和紫外交联实验，发现在肺癌细胞中MALAT1的转录产物RNA与其关键调控转录因子SP1蛋白之间存在直接的相互结合作用。wound-healing实验与transwell实验的结果表明MALAT1表达水平的上调会促进肿瘤细胞系在体外的迁移与侵袭;MALAT1表达水平的下调对肿瘤细胞系在体外的迁移与侵袭能力都有很好的抑制作用。随后在裸鼠皮下注射肿瘤细胞，待长出肿瘤后对肿瘤的大小进行测量，结果显示下调MALAT1会抑制肿瘤的生长。此外，临床组织标本的研究显示，肺癌病人切除的肿瘤标本中MALAT1与SP1的表达量相比于普通正常人的肺组织都是升高的。
　　结论:(1)在肺癌细胞中MALAT1的转录产物与其关键转录因子SP1蛋白之间存在直接的相互结合作用，这种结合稳定了SP1蛋白的结构，并延长了SP1蛋白的半衰期。SP1蛋白又是自身SP1基因转录的关键转录因子。因此，SP1表达量受到MALAT1表达量的调控，SP1与MALAT1之间就形成了一个正反馈转录环路。(2)干扰MALAT1的转录，可以下调SP1蛋白水平并抑制相关下游基因的转录，对肿瘤的生长与转移能力都有显著地抑制作用。(3)在临床标本中MALAT1转录水平与SP1的表达水平也存在相关性。因此，这一环路的阐明为肺癌的临床治疗提供了靶标。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 文献综述

2．MALAT1的转录调控

3．MALAT1的定位与功能

4．MALAT1与癌症

二、转录因子SP1的研究进展

1．SP／KLF蛋白家族

2．SP1介导的转录调控

3．SP1与肿瘤

三、肺癌的研究进展

1．肺癌的分类与临床症状

2．引发肺癌的因素

3．肺癌的治疗现状

第二部分 结果与讨论

一、绪论

二、实验材料与方法

三、实验结果与讨论

第二章：MALAT1 RNA调节SP1表达量的作用方式研究

一、绪论

二、实验材料与方法

三、实验结果与讨论

第三章 MALAT1-SP1转录反馈环路在肿瘤生长转移以及临床治疗中的作用

一、绪论

二、实验材料与方法

三、实验结果与讨论

参考文献

主要缩略词注释表

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