生物样本百草枯检测方法的建立及临床应用

摘要

第一部分高效液相色谱串联质谱技术测定血液、尿液中百草枯浓度
　　目的:优化一种利用电喷射接口串联超高液相色谱仪及高分辨质谱仪测定血浆、尿液中百草枯浓度的方法。进而精确检测百草枯中毒后在体内的浓度，提供相应临床治疗的指导依据。
　　方法:通过乙腈进行一步蛋白沉淀处理，即可制备上机样品，样品通过亲水性液相色谱柱（HICIL Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography）完成分离，借助高效质谱仪使用阴离子射线模式（Targeted-MS/MS scan mode）完成样本测定。在此过程中优化流动相中甲酸铵及甲酸浓度，电喷雾电压，毛细管加热温度，系统加热温度，质谱仪碰撞能等检测条件。
　　结果:在尿液测定中，本方法测定下限可达0.3 ng/ml，检测上限为1000ng/ml。血浆测定中，测定下限为0.8 ng/ml，检测上限为1000 ng/ml。该方法在可测定的上下限浓度之间呈现良好的线性关系，尿液测定方法日间精密度和日内精密度均小于4.78％，血浆测定方法的日间精密度和日内精密度均小于7.97％。该测定方法的样本回收率为93.51-100.90％。
　　结论:该研究利用高效液相色谱串联质谱技术，建立并优化了一种操作简单，准确性，敏感性，特异性高，用于测定人和猪血液、尿液百草枯浓度的方法。该检测方法的建立可为临床百草枯中毒剂量评估及患者相关治疗提供参考，具有重要的临床意义。
　　第二部分高效液相色谱串联质谱技术评估百草枯中毒患者预后
　　百草枯属剧毒物，对人有很强的毒性，易导致多器官功能障碍。随着医学技术的发展，近年来百草枯中毒救治存活率有所上升，尽管如此，其病死率仍然居高不下，达50％。研究显示，患者死亡率与体内百草枯浓度呈正相关，因而及时、准确建立百草枯体内的测定方法显得尤为重要。
　　目的:建立一种高效液相色谱串联质谱技术，测定患者血浆中百草枯含量，预测百草枯患者病情严重程度及预后，从而指导百草枯的临床治疗。
　　方法:本实验选取了南京医科大学第一附属医院2015年8月至2016年12月期间确诊的35例百草枯中毒患者，患者入院后立即行血常规，肝肾功能，凝血，血气分析等检查，洗胃、血液灌流、维持水电解质平衡、补液等常规治疗。利用高效液相色谱串联质谱技术测定患者血浆中百草枯含量，以患者血液百草枯浓度将患者分为高、中、低3个剂量组，进而评估患者百草枯中毒严重程度及预后。
　　结果:患者血液百草枯浓度预测死亡率的ROC曲线下面积为0.957(P＜0.0001)。百草枯中毒严重指数(SIPP)预测死亡率ROC曲线下面积为0.928，(P＜0.0001)。高、中、低3个剂量组患者，白细胞计数、血清钾、血清钠、肌红蛋白等指标方面，差异有统计学意义。
　　结论:血液中百草枯浓度及百草枯中毒严重指数可作为重要的评估指标，在百草枯中毒患者病情严重程度及预后的评估中发挥重要作用。
　　第三部分连二亚硫酸钠在百草枯猪急性中毒模型胃液快速检测中的应用
　　目的:建立连二亚硫酸钠紫外分光光度法检测胃液中百草枯浓度的检测方法。
　　方法:将样品解冻，充分涡旋后，以3000rpm转速离心10min，微量移液器吸取上清液900ul至比色皿中进行扫描，而后加入100ul检测液，轻轻摇匀后，选择最佳波长进行扫描，每个样品计算加入检测液前后吸光度差值。
　　结果:实验设计的9点校正曲线覆盖线性范围从1-500ug/ml(1，2，5，10，20，50，100，200，500ug/ml)中，体现了良好的线性，R＞0.99。日间精密度在4.70-6.23％之间，日内精密度在4.82-6.67％之间。回收率在99.18％-117.81％之间。
　　结论:本实验建立的连二亚硫酸钠紫外分光光度法可用于检测猪百草枯灌胃模型胃液、洗胃液中百草枯浓度。本方法灵敏准确，可用于胃液、洗胃液百草枯浓度的评估。

目录

声明

摘要

第一部分 高效液相色谱串联质谱技术测定血液、尿液中百草枯浓度

1 前言

2 材料及方法

3 结果和讨论

4．小结

参考文献

第二部分 液质联用技术测定血百草枯浓度评估百草枯中毒患者预后

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 连二亚硫酸钠在百草枯猪急性中毒模型胃液快速检测中的应用

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

文献综述 百草枯浓度检测方法研究进展

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢