STIM1激活在百草枯所致急性肺损伤中的作用及其机制研究

摘要

目的：百草枯（paraquat，PQ）是一种常被误用的剧毒除草剂，尤其在发展中国家，因百草枯中毒死亡的现象非常常见。相较于PQ中毒引起的慢性肺纤维化的大量研究报道，急性大量PQ中毒引起的急性肺损伤背后的机制，仍然缺乏相应的研究。在各种外界条件的刺激下，细胞内钙稳态的改变和氧化应激的产生，都与细胞周期进程和细胞死亡紧密相关。PQ被公认可以引起氧化应激的产生，但是否钙离子参与其中的调控机制仍是未知的。近期有研究发现，在内质网上一个功能多样的钙离子感受器——基质相互作用分子1（STIM1），能有效感受内质网内钙离子浓度的变化从而发挥对细胞各项功能的调控作用。然而，STIM1在PQ诱导的急性肺中毒中的调节机制和作用仍然缺乏相应的研究。本研究的目的是探讨PQ诱导肺急性中毒的分子和细胞机制，从而能进一步确定钙信号和活性氧簇（ROS）是否参与调控机制的作用。 方法：1.C57BL/6小鼠腹腔注射75mg/kg PQ处理48h构建PQ急性中毒的在体模型，16HBE用于体外模型的构建；2.LDH、MTT试剂盒以及台盼蓝染色用于检测 PQ处理用细胞死亡情况，TUNEL试剂盒用于检测细胞凋亡情况；3.构建STIM1过表达质粒，并使用CRISPR-CAS9技术敲除16HBE STIM1基因或抑制SOCE活性探寻STIM1在PQ引起的急性肺损伤中的调控作用；4.流式细胞技术检测细胞周期各个时期细胞占比情况；5. L-012用于检测胞外活性氧的产生，DHE染色用于ROS胞内产生情况的检测；6.钙离子荧光探针Fluo-8 AM，用于检测胞内钙离子瞬变的情况；7. qPCR和蛋白免疫印迹实验用于检测相关基因转录和翻译水平的改变等。 结果与结论：我们的数据表明，500μM PQ处理16HBE24小时后，可以诱导细胞内ROS产生并增强与STIM1激活诱导的钙库调控的钙离子内流（SOCE）的活性。此外，500μM PQ处理24-48小时后，引起细胞周期G1/S期的加速转变，并减缓了S期向G2/M期的转变速度，然后导致大量细胞停滞在S期中，引起细胞死亡。而在16HBE中敲除STIM1或抑制STIM1介导的SOCE激活可改善急性PQ中毒引起的细胞死亡，这也通过调节CyclinD1，p21，CyclinA2和CDK2的表达来调节S期细胞的积聚。本研究揭示了STIM1在急性PQ诱导的细胞周期转换和细胞死亡中发挥着重要的作用，这可能为我们提供一个靶向治疗百草枯诱导急性中毒的新方向。

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