基于流动注射的无创样品中生物标志物检测方法研究

摘要

学习科学的研究旨在探索与人类（特别是儿童）学习能力相关的生物学、心理学和社会学机制，研究影响人类学习能力的生物学、心理学和社会学因素及其客观的评价方法和技术。这些方法和技术包括心理学方法、生理的方法以及生化的方法。生化指标因为客观性较强及易于采集等，越来越受到重视。生物标志物是从生物学介质中可以检测到的细胞、生物化学或分子改变。这里的生物学介质包括各种体液（如血液、尿液）、粪便、组织、头发、呼吸气体等。采血液是目前临床和科学研究中常用的一种方式，但这种方式本身是一种创伤，会对被采样者造成痛苦，导致不配合采样等情况的出现;同时，其本身也是一种急性应激源，可能造成人体应激反应，导致生物标志物瞬时变化，影响研究结果。近年来唾液等无创样品的测定在精神神经内分泌研究中显得日益重要，这种无创性的采样方式简便、易被接受，尤其适合儿童研究。然而无创样品粘稠，成分复杂，干扰物质多，且待测物浓度一般都很低，因此，往往需要昂贵的大型检测设备进行检测。学习科学研究中需要的生化指标，往往需要大样本量的人群数据，用大型设备进行检查费时费力且成本较高。对便携式的检测仪器和方法的需求日益凸显。本研究组用电纺纳米纤维作为固相吸附剂，开展分析样品前处理研究，由于电纺纳米纤维具有极高的比表面积，与目标分子相互作用的位点明显增加，吸附和脱附速度快，与现有萃取填料相比，提取富集效率显著提高;有机溶剂用量大大减少，最大限度的降低对人体的危害;萃取操作简便易行，易于自动化。而固相萃取往往包括活化，上样，淋洗，洗脱等过程，需要的试剂种类较多。此外，唾液α-淀粉酶等靠催化反应来进行的生物标志物检测，对反应时间的要求非常高，而流动注射技术是溶液自动在线处理及测定的现代分析技术，最多可以将十多种试剂同时或有序进入并进行反应，具有分析速度快、准确度和精密度高、设备和操作简单、通用性强、试样和试剂用量少等一系列优点。因此将流动注射技术用于无创样品中的生物标志物检测，可以提高检测效率的同时，确保检测结果的准确度，恰好可以满足学习科学对于生化指标的检测要求。
　　在此基础上，本文主要进行了以下几个方面的研究:(1)基于纳米纤维的分离富集作用，建立液相色谱-流动注射化学发光在线联用检测样品中的5-羟色胺的方法。(2)建立基于流动注射的纳米纤维固相萃取与光度法在线联用的样品检测方法。(3)建立纳米纤维在线固相萃取-电化学检测样品中的铅的方法。(4)建立流动注射-分光光度法检测唾液α-淀粉酶活性的方法。(5)将流动注射法测唾液α-淀粉酶活性应用于学龄前儿童肥胖相关研究。(6)将流动注射法测唾液α-淀粉酶活性应用于应激相关研究。
　　论文主要工作如下:
　　一、基于纳米纤维的分离富集作用，建立液相色谱-流动注射化学发光联用检测样品中的5-羟色胺的方法。
　　5-羟色胺是一种重要的单胺类中枢神经递质，广泛存在于脊椎动物脑内，参与多种生理进程，包括平滑肌收缩、血压调控、中枢和周围神经系统神经传递。与类癌症候群，抑郁症以及神经分裂等病症密切相关，因此，5-羟色胺的检测有其重要意义。本研究基于纳米纤维的分离富集作用，设计了离线纳米纤维固相萃取，液相色谱-流动注射化学发光在线联用检测样品中的5-羟色胺的方法。并对固相萃取条件，化学发光条件等进行优化。结果表明，该方法在20-1000 ng/mL的范围内线性良好。标准曲线方程为y=-0.0035+0.00178x(R2=0.996)。检出限为5 ng/mL。日内和日间精密度分别为7.3％和6.4％，均小于10％。
　　二、建立基于流动注射的纳米纤维固相萃取与光度法联用的样品检测方法
　　分光光度法是一种常见的目标物检测方法，本研究以流动注射为基础，将在线纳米纤维固相萃取技术与光度法检测联用，以一种荧光染料罗丹明B为目标物，验证该方法的可行性。与传统的固相萃取技术不同，纳米纤维固相萃取技术有明显的填料用量少，吸附效率高的优势。同时，考虑到纳米纤维固相萃取技术的应用方面，目前没有相应的固相萃取装置可以借鉴，本研究针对性地设计了在线纳米纤维固相萃取装置，可以实现24个固相萃取柱的自动切换;优化了在线纳米纤维固相萃取的流路和步骤;比较了不同构造的可见光检测器。最终建立了基于流动注射的纳米纤维固相萃取与光度法联用的样品检测方法。该方法在25-1000 ng/mL的范围内线性良好，线性方程为:y=0.0012x+0.0442(R2=0.995)。检出限为7.5 ng/mL。日内和日间精密度分别为7.4％和8.1％，均低于10％。样品的加标回收率在94.21％和105.07％之间。
　　三、建立纳米纤维在线固相萃取-电化学检测样品中铅的方法
　　铅、镉、铜等重金属会引起严重的环境污染，并且会威胁人类健康。尤其是儿童正处在生长发育阶段，铅超标会影响儿童的智力，包括语言能力、记忆力和注意力等。因此，对铅的检测就显得极为重要。电化学检测方法是检测样品中重金属的比较简便的方法。本研究以流动注射为基础，设计了在线纳米纤维固相萃取与电化学检测器联用的方法，并对在线预浓缩操作、电化学系统的富集电压、富集时间等参数进行了优化。结果表明，该方法在5-100μg/L的范围内线性良好，标准曲线方程为y=-0.0035+0.00178x(R2=0.998)。检出限为0.38μg/L。日内和日间精密度分别为4.7％和5.4％，均小于10％。将该方法应用于5名儿童孤独症儿童尿液中的铅含量测定，测定结果为4.97±0.52μg/L，高于文献报道的三岁儿童中位数2.64μg/L。
　　四、建立流动注射-分光光度法检测唾液α-淀粉酶活性的方法
　　唾液蛋白的分泌是交感神经系统和副交感神经系统协调作用的结果。当交感神经兴奋时，唾液α-淀粉酶分泌增加，其反应速度比去甲肾上腺素、皮质醇等激素还要快。因此，随着唾液α-淀粉酶(salivary alpha-amylase，sAA)活性检测的有效性和可靠性日益被认可，它已成为一种反映人体自主神经系统在压力及压力相关刺激下发生变化最为敏感的生物标记物。目前已有比色法，试纸法等唾液α-淀粉酶的检测方法，但均存在操作繁琐，成本较高等缺点，尚未有标准的方法。本课题组基于碘淀粉显色反应的机理，提出了用流动注射检测唾液α-淀粉酶活性的方法。本研究在此基础上进行改进，提出了一次记录、多次进样的检测模式，并提出了在线校正唾液α-淀粉酶活性的设计。研制的仪器无需对样品进行复杂前处理即可检测，操作快速、简便，且具有良好的回收率和准确性。
　　五、流动注射法测唾液α-淀粉酶活性在学龄前儿童肥胖相关研究中的应用
　　肥胖症是由于机体脂肪过多或脂肪组织与其他软组织比例过高而引起的，是一种营养过剩造成的营养不良性疾病。肥胖会对儿童的身心健康造成影响，出现自卑、缺乏自信、抑郁、焦虑等异常心理和行为，成人后易患上高血压、高血脂、高胰岛素血症、肝功能异常等疾病。因此对儿童肥胖进行评估，并探讨与儿童肥胖相关的生物标志物就有其重要意义。本研究将流动注射法测唾液α-淀粉酶活性应用于学龄前儿童肥胖相关研究，选取了肥胖组和对照组共各30例被试，同时收集了家长相关信息，数据和信息分析发现儿童体质指数(BMI)和母亲BMI在肥胖组和对照组间的差异有统计学意义(P＜0.05)，将被试按照母亲BMI分值高低进行分组，发现儿童唾液α-淀粉酶的活度值的差异有统计学意义，进一步做相关分析发现被试唾液中唾液α-淀粉酶活性与母亲BMI显著相关。国内尚未发现唾液α-淀粉酶活性与肥胖相关的研究结果，国外的研究中虽有报道，但研究对象年龄较大（成人，青少年及10岁左右儿童），且不同年龄段唾液α-淀粉酶活性与肥胖相关性不同，因此本研究可以填补学龄前儿童这一年龄段的空白。
　　六、流动注射法测唾液α-淀粉酶活性在应激相关研究中的应用
　　应激是一种当机体内环境稳定受到威胁时，机体对应激源产生的特异性和（或）非特异性反应。心血管疾病、神经精神病、胃肠疾病和内分泌疾病等高发病率的疾病与应激密切相关，也对人的学习和认知过程产生影响。随着现代社会和经济的发展，人的精神压力越来越大，而这些压力，往往会导致疾病的产生。多种研究表明，唾液中的唾液α-淀粉酶活性会随着人精神压力的增大而急剧升高。因此，通过检测唾液中的唾液α-淀粉酶活性来了解人精神压力状况便成为可能。本研究招募40名大学生作为被试，将5分钟演讲作为应激源，并要求被试填写一般情况问卷和艾森克人格问卷，收集被试演讲开始前，演讲结束时、结束后15分钟和20分钟的唾液样品，并采用已建立的流动注射的方法检测样品中的唾液α-淀粉酶活性。按照艾森克人格问卷的内外向性（E维度）进行分组，并用单因素重复测量方差分析的方法进行统计，结果显示高分值组和低分值组α-唾液淀粉活性变化间的差异有统计学意义。进一步对E分组的高分值组和低分值组分别进行重复测量的方差分析，发现低值组各个时间点间α-唾液淀粉活性的变化无统计学差异(P=0.383＞0.05)，而高值组各个时间点间α-唾液淀粉活性的变化则有统计学差异(P=0.014＜0.05)。更进一步对高分值组不同时间点间的α-唾液淀粉活性进行两两配对t检验。结果表明在高分值中，演讲前与演讲结束时;演讲结束后15分钟与演讲结束后20分钟的α-唾液淀粉活性的差异分别有统计学意义。已有国外研究发现自我怜悯量表Self-Compassion Scale(SCS; Neff,2003b)中自我怜悯对α-唾液淀粉活性应激反应有负性影响;也有研究表明大五人格量表中的神经质以及状态-特质焦虑量表State-trait-anxiety inventory(STAI)中的特质焦虑与被试实验日的α-唾液淀粉活性呈正相关。而本研究使用的艾森克人格问卷具有较高的信度和效度，其所测得的结果可同时得到多种实验心理学研究的印证，本研究结果可为用客观测量而非量表的方法来评价人格特质提供依据。

目录

声明

摘要

主要缩写词表

第一章 绪论

1．1．学习科学

1．1．1 学习科学的概念

1．1．2 学习科学的研究目标

1．1．3 学习科学的研究方法

1．2 无创样品中生物标志物的检测

1．2．1 生物标志物的概念

1．2．2 生物标志物的分类

1．2．3 生物标志物的应用领域

1．2．4 无创样品中的生物标志物

1．2．5 无创样品中生物标志物的检测方法

1．3 流动注射分析技术

1．3．1 流动注射分析技术的发展

1．3．2 流动注射分析技术的原理

1．3．3 流动注射分析技术的特点

1．3．4 流动注射分析技术在无创样品生物标志物分析中的应用

1．4 流动注射分析技术与固相萃取技术联用

1．5 本论文研究内容

第二章 液相色谱-流动注射化学发光联用检测样品中的5-羟色胺

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器

2．2．2 溶液配制

2．2．3 色谱条件

2．2．4 制备纳米纤维固相萃取柱

2．2．5 固相萃取过程

2．2．6 高效液相色谱-流动注射分析系统

2．3 结果与讨论

2．3．1 分析系统的设计

2．3．2 PS-PCE复合纳米纤维的形貌

2．3．3 化学发光条件的考察

2．3．4 手持式纳米纤维固相萃取柱加压装置

2．3．5 方法学

2．3．6 实际样品检测

2．4 结论

第三章 纳米纤维固相萃取与流动注射联用初探

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器和试剂

3．2．2 溶液配制

3．2．3 制备纳米纤维固相萃取柱

3．2．4 流动注射系统

3．3 结果与讨论

3．3．1 PS纳米纤维的形貌

3．3．2 纳米纤维在线固相萃取装置

3．3．3 实验方法

3．3．4 方法学

3．3．5 加标回收实验

3．3．6 与现有方法比较

3．4 结论

第四章 纳米纤维在线固相萃取-电化学检测样品中的铅

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 溶液和试剂

4．2．2 仪器和设备

4．2．3 电纺纳米纤维的制备和固相萃取柱填装

4．2．4 流动注射系统

4．3 结果与讨论

4．3．1 PS-DZ纳米纤维的形貌

4．3．2 预浓缩部分

4．3．3 检测部分

4．3．4 方法学

4．3．5 实际样品检测

4．4 结论

第五章 流动注射-分光光度法检测唾液α-淀粉酶

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 仪器与试剂

5．2．2 溶液配制

5．2．3 样品采集

5．2．4 流动注射系统

5．3 结果与讨论

5．3．1 实验方法

5．3．2 方法学

5．3．3 实际样品检测

5．4 结论

第六章 流动注射法测唾液α-淀粉酶在学龄前儿童单纯性肥胖研究中的应用

6．1 引言

6．2．1 研究对象

6．2．2 研究方法

6．2．3 统计学分析

6．3 结果

6．3．1 一般情况

6．3．2 BMI分析

6．3．3 唾液α-淀粉酶活性分析

6．4 讨论

6．4．1 关于儿童肥胖情况

6．4．2 唾液α-淀粉酶与肥胖相关情况

6．5 结论

第七章 流动注射法测唾液α-淀粉酶在应激相关研究中的应用

7．1 引言

7．2 对象与方法

7．2．1 研究对象

7．2．2 研究方法

7．2．3 统计学分析

7．3 结果

7．3．1 一般情况

7．3．2 艾森克人格问卷结果

7．3．3 唾液α-淀粉酶活性变化情况

7．3．4 唾液α-淀粉酶活性变化情况与艾森克人格量表结果间的关系

7．4 讨论

7．4．1 艾森克人格问卷结果分析

7．4．2 唾液α-淀粉酶变化情况分析

7．4．3 以艾森克人格问卷结果为分组因素的重复测量分析

7．5 结论

结论与展望

致谢

参考文献

作者简介