miR-143调节血脑屏障完整性及其调控机制

摘要

本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 miR-143调节甲基苯丙胺致血脑屏障损伤中的作用 目的：中枢神经系统疾病大多伴有严重的神经炎性反应，早期研究结果表明，神经炎性反应在脑内病理过程中起重要作用。血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）损伤是甲基苯丙胺致神经炎性反应的重要事件，而miRNA参与BBB的功能调节，研究miR-143在正常小鼠及甲基苯丙胺诱导成瘾小鼠的脑组织之间表达差异，明确miR-143在甲基苯丙胺诱导的BBB破坏中的作用，有助于更新现有关于成瘾致BBB损伤发生和治疗的理论，对临床治疗策略和治疗药物靶标的创新重要意义。 方法：对高通量miRNA芯片数据进行结果分析，筛选出甲基苯丙胺成瘾患者血清中表达显著升高的miR-143；进一步分析miR-143在BBB完整性中的作用及其与神经炎性反应之间的关系，应用real-time PCR检测miRNA-143（miR-143）和靶蛋白PUMA mRNA表达水平；应用原位杂交免疫荧光检测内皮细胞标志物CD31与miR-143共定位；应用双光子荧光显微成像技术检测血管通透性和BBB完整性；应用Western blot检测紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）、转录因子（p53、NF-κB、STAT3）、信号通路（ERK、p38、JNK、Akt）蛋白表达水平；应用transwell通透性实验检测人脑微血管内皮细胞通透性；应用染色质免疫沉淀技术检测转录因子与其靶标分子的结合；应用慢病毒转染和小鼠脑微注射技术，结合Western blot和免疫荧光染色技术，在离体和整体水平上验证sigma-1R/miR-143/PUMA轴在BBB完整性中的作用。 结果：1）甲基苯丙胺上调脑区（海马、皮层、中脑）和脑微血管内皮细胞中miR-143表达；2）整体水平上，沉默miR-143改善甲基苯丙胺诱导的紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）降低，减轻BBB损伤；3）细胞水平上，沉默miR-143改善甲基苯丙胺引起的人脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）降低，改善内皮细胞通透性增加；4）小鼠脑微注射Anti-miR-143慢病毒可改善由甲基苯丙胺引起的紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）降低和BBB损伤；5）PUMA为miR-143靶基因；6）细胞水平上，沉默PUMA降低内皮细胞紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）表达，内皮细胞通透性增加；过表达PUMA增加人脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）表达，降低内皮细胞通透性；7）PUMA正向调控转录因子p53、NF-κB，从而影响下游紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）表达；8）sigma-1R正向调控miR-143参与调控甲基苯丙胺诱导的BBB损伤过程；9）甲基苯丙胺诱导人脑微血管内皮细胞中MAPK与PI3K/Akt信号通路激活，信号分子发生磷酸化；10）甲基苯丙胺诱导人脑微血管内皮细胞核转录因子STAT3活化，ERK，p38，JNK，PI3K特异性抑制剂预处理细胞后均能显著抑制核转录因子STAT3表达；11）核转录因子STAT3调控靶标分子miR-143表达。 结论：甲基苯丙胺通过sigma-1受体激活MAPK与PI3K/Akt信号通路引起转录因子STAT3调控miR-143转录，miR-143靶向PUMA引起紧密连接蛋白表达降低，BBB通透性增加最终导致BBB损伤。沉默miR-143能够缓解甲基苯丙胺引起的BBB损伤，为成瘾性药物致BBB损伤的研究和临床治疗提供理论依据和新的靶标。 第二部分 miR-143调节脑卒中致血脑屏障损伤中的作用 目的：脑卒中是以局灶性神经功能缺失为特征的急性脑血管病。BBB损伤是脑卒中发生发展的重要始动因素之一，而miR-143参与BBB的功能调节，circDLGAP4转录本存在与miR-143结合的位点，研究circDLGAP4靶向miR-143调节脑卒中BBB损伤分子作用机制，明确circDLGAP4/miR-143在脑卒中BBB破坏中的作用。有助于更新现有关于脑卒中致BBB损伤发生和治疗的理论，为治疗脑卒中BBB损伤提供新的视角和治疗策略。 方法：应用Real-time PCR检测miR-143和circDLGAP4表达水平；应用TTC方法和MRI方法检测tMCAO脑卒中模型小鼠梗死体积；应用尾静脉注射Evans Blue方法检测tMCAO脑卒中模型小鼠BBB通透性；应用Western blot技术检测紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）、间充质转化标志物（collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA）、HECTD1蛋白表达水平；应用荧光素酶报告基因（Luciferase）验证circDLGAP4与miR-143相互结合作用；应用RNA pull down和原位杂交共定位实验验证circDLGAP4与miR-143存在相互结合；应用慢病毒转染和小鼠脑微注射技术，结合Western blot和免疫荧光染色技术，在离体和整体水平上验证circDLGAP4/miR-143/HECTD1轴在脑卒中引起的BBB损伤中的作用。 结果：1）缺血性脑卒中引起miR-143上调、BBB损伤；2）整体水平上，沉默miR-143缓解由脑卒中引起的BBB损伤、紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）降低和间充质转化标志物（collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA）增加，减小梗死体积；3）circDLGAP4结合吸附miR-143，缺血性脑卒中引起circDLGAP4下调；4）整体水平上，过表达circDLGAP4缓解由tMCAO脑卒中模型引起的BBB损伤、紧密连接蛋白（claudin-5、occlduin、ZO-1）降低和间充质转化标志物（collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA）增加，减小梗死体积；5）细胞水平上，过表达circDLGAP4能够抑制由OGD/R造成的紧密连接蛋白降低和间充质转化标志物增加；6）细胞水平上，过表达circDLGAP4能够缓解miR-143引起的紧密连接蛋白降低和间充质转化标志物增加；7）细胞水平上，间充质转化抑制剂SIS3能够缓解miR-143引起的紧密连接蛋白降低和间充质转化标志物增加；8）miR-143靶向调节HECTD1表达；9）miR-143通过靶向调控HECTD1调节内皮细胞间充质转化；10）整体tMCAO脑卒中模型和细胞OGD/R引起HECTD1下调；11）过表达HECTD1能够缓解由OGD/R造成的紧密连接蛋白降低和间充质转化标志物增加。 结论：在缺血性脑卒中条件下激活脑微血管内皮细胞内circDLGAP4/miR-143/HECTD1发生间充质转化导致BBB损伤。增加BBB通透性最终导致BBB损伤。沉默miR-143和过表达circDLGAP4能够缓解脑卒中引起的BBB损伤，对治疗脑卒中BBB损伤提供新的视角和治疗策略。

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