新型纳米电化学p16INK4a基因及其表达蛋白的传感分析与研究

摘要

恶性肿瘤是威胁人类健康的主要原因之一。肿瘤生物标志物是明确癌症状态的可量化指标，包括DNA、RNA、蛋白质、脂质、代谢物等生物活性物质和因子。肿瘤生物标志物的分析评估可实现从细胞和分子水平研究肿瘤的发生和发展过程，为制定预防癌症的有关措施提供依据，对癌症的综合防治有深远意义。 传统的肿瘤生物标志物分析法在灵敏度、速度及检测成本方面存在很大局限性。生物传感技术是以生物活性材料为识别元件，将生化反应转变成可定量的物理/化学信号，从而进行生命物质、化学物质检测及监控的高新技术。目前，根据理化换能器的不同，常见的生物传感器主要有光学、压电和电化学等类型。其中电化学方法过程简单快速、灵敏度高、选择性好、成本低、不受样品颜色和浊度的影响及所需仪器设备简单，是检测肿瘤生物标志物最具潜力的一种方法。近十多年来，肿瘤生物标志物电化学传感技术有了迅速的发展。然而，面对组成复杂、检测靶标浓度极低的生物样本，肿瘤生物标志物电化学传感技术在灵敏度、选择性等分析性能方面还有待进一步加强与提高。 本论文以肿瘤生物标志物分析检测面临的关键问题----灵敏度低、检测复杂、特异性差为切入点，从生物分子固定载体材料、电化学检测信号放大策略两方面着手，建立新型纳米电化学传感分析系统。具有超大比表面积、电子传递速率快及良好生物相容性的功能纳米杂合物修饰电极用来构建新型生物分子固定化活性界面；经共掺杂合金核壳光学复合纳米颗粒/酶-电子介体聚合物催化免疫体系快速简便实现电化学检测信号的连续多重放大，协同碱基互补杂交/双位点夹心法的高特异性和敏感性，以期建立系列高灵敏快速检测肿瘤生物标志物的新方法，为肿瘤生物标志物的分析检测提供一种新思路。论文共五章，具体内容如下： 第一章 绪论 本章就目前国内外有关p16INK4a基因及其产物蛋白的传统、新型检测技术进行概述和比较，重点阐述电化学传感技术的最新相关应用及其不足，并提出本论文的研究目的、创新特色及研究意义。 第二章 基于NPTh修饰电极的电致化学发光传感平台特异性检测p16INK4a基因 基于纳米聚硫堇（NPTh）修饰电极、共掺杂合金核壳光学复合纳米颗粒（RuAg@AuNPs）标记DNA放大检测信号，构建三明治型电致化学发光（ECL）生物传感器，实现p16INK4a基因的特异性检测。采用原位电聚合技术成功制备NPTh修饰电极，经电荷吸附有效地将ssDNA1固载在其表面。Ru(bpy)32+/银纳米颗粒（AgNPs）共掺杂金（Au）的合金核壳光学复合纳米颗粒RuAg@AuNPs作为ssDNA2的信号标记物，其呈现良好的电化学行为。杂交反应后，p16INK4a基因在1.0×10-13~1.0×10-10mol/L范围内有良好的电化学响应，检出限为5.0×10-14mol/L（S/N=3），且可用于单碱基错配的区分。 第三章 基于PG/GR/CS/PPy修饰SPCE的电致化学发光传感平台特异性检测p16INK4a基因 基于功能化的糊状纳米纤维复合物（PG/GR/CS/PPy）修饰丝网印刷碳电极（SPCE）设计一种电致化学发光检测p16INK4a基因的传感系统。将一步电纺技术制备的石墨烯（GR）掺杂聚酰胺6（PA6）的电纺纳米纤维、GR及壳聚糖（CS）混合，得到糊状纳米纤维复合物（PG/GR/CS）；PG/GR/CS作为吡咯（Py）电聚合的纳米骨架，获得PG/GR/CS/PPy修饰电极；三明治复合物dsDNA由ssDNA1、p16INK4a、RuAg@AuNPs-ssDNA2通过杂交反应形成并进一步固定在PG/GR/CS/PPy表面以构建传感系统。在最优条件下，p16INK4a基因在1.0×10-13~1.0×10-9mol/L范围内呈良好的线性响应，检出限为5.0×10-14mol/L（S/N=3）。该法可再生、线性范围宽，实际应用潜能较大。 第四章 基于PA6-MWCNTs-SiO2修饰电极的电致化学发光传感平台特异性检测p16INK4a基因 基于功能电纺纳米杂合纤维（PA6-MWCNTs-SiO2）修饰电极设计了一种灵敏的电致化学发光检测p16INK4a基因的传感系统。由静电纺丝技术制备多壁碳纳米管（MWCNTs）掺杂PA6纳米杂合纤维（PA6-MWCNTs），PA6-MWCNTs经多电位阶跃法进行电沉积纳米硅（SiO2），获得PA6-MWCNTs-SiO2修饰电极。PA6-MWCNTs-SiO2修饰电极较SiO2修饰电极的比表面积放大约4倍。将PA6-MWCNTs-SiO2修饰电极作为固定ssDNA1的载体，可有效提高DNA的固载量和杂交反应的灵敏度，协同标记物RuAg@AuNPs有效放大检测信号。在最优条件下，p16INK4a基因在1.0×10-15~1.0×10-12mol/L范围内呈良好的线性响应，检出限降低了两个数量级，为5.0×10-16mol/L（S/N=3，n=11）。 第五章 基于PG/GR/CS/PMB修饰电极的电化学免疫传感器特异性识别AGp16INK4a蛋白 基于功能化的糊状纳米纤维复合物（PG/GR/CS/PMB）修饰电极建立酶-电子介体聚合物催化免疫传感检测AGp16INK4a蛋白的方法。以糊状纳米纤维复合物（PG/GR/CS）修饰电极作为电聚合羧化MWCNTs掺杂亚甲蓝（MB）的纳米骨架，获得的功能化的糊状纳米纤维复合物（PG/GR/CS/PMB）作为Ab1的固载基底；经双位点夹心法获得三明治复合物（Ab1-AGp16INK4a-HRP@Ab2），由PMB-HRP-过氧化氢（H2O2）体系经酶催化放大检测信号。AGp16INK4a蛋白在1pg/mL~1ng/mL范围内有良好的线性响应，检出限为0.5pg/mL（S/N=3，n=11）。

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