新型锌指蛋白-ZC3H4参与SiO2诱导巨噬细胞活化的机制研究

摘要

目的：二氧化硅（SiO2）粉尘进入肺泡，被肺泡巨噬细胞（AM）吞噬，发生一系列炎症反应，释放炎症因子以及纤维化因子作用于其它靶细胞，如肺成纤维细胞（PFB）会发生过度增殖和迁移，从而导致纤维化，而AM的活化在此过程中扮演了重要角色。MCPIP1是本实验室前期研究的一个靶蛋白，又名ZC3H12A，是2006年发现的一个CCCH型锌指蛋白，在巨噬细胞含量丰富的器官中表达水平较高，可能参与炎性过程与免疫反应。本课题组通过对CCCH型锌指蛋白MCPIP1的探究发现，其在SiO2刺激AM活化的过程中发挥了重要作用。ZC3H4是一种新发现的CCCH型锌指蛋白，作为MCPIP1同家族成员，其是否参与肺纤维化尚未见报道，因此本课题对ZC3H4在SiO2引起的肺泡AM的活化中的作用及其机制进行探究。 方法：利用巨噬细胞系RAW264.7建立离体SiO2刺激模型（50μg/cm2），蛋白免疫印迹（Western blot）结合细胞的免疫荧光（Immunocytochemistry）以及免疫组织化学（Immunohistochemistry）检测AM中ZC3H4和AM活化的蛋白标志物，同时利用CRISPR/Cas9技术特异性敲减ZC3H4的表达，验证其与AM活化的关系；利用三维（3D）巢式基质模型检测ZC3H4对PFB迁移的影响。为了探究AM中ZC3H4表达的调控机制，利用q-PCR检测环状RNA-circZC3H4的水平，应用siRNA技术特异性敲减circZC3H4分析其对ZC3H4表达的调控以及对AM活化的影响。利用miR-212的拮抗物和模拟物调控miR-212的表达，结合荧光原位杂交（FISH）技术检测circZC3H4和miR-212是否有共定位，并用RNA pull-down实验检测二者是否有结合，进而对circZC3H4的调控机制进行进一步探究。同时，利用人单核细胞系U937和临床人肺泡灌洗液分离得到的肺泡AM验证上述现象。 结果：1）SiO2刺激引起AM中ZC3H4表达显著上升，并伴随AM的活化标志物显著增加；2）敲减ZC3H4显著抑制SiO2引起的上述现象；3）3D迁移实验显示，SiO2刺激的AM条件培养基引起PFB迁移增加，敲减ZC3H4显著抑制这一作用；4）SiO2刺激引起AM中circZC3H4的水平显著上升，敲减circZC3H4后能够显著抑制ZC3H4表达升高以及AM活化现象；5）miR-212参与调控ZC3H4的表达，circZC3H4通过和miR-212相互作用，以ceRNA机制参与ZC3H4表达调控；6）SiO2刺激引起U937中ZC3H4蛋白表达升高，临床人肺泡巨噬细胞样本中均观察到ZC3H4表达显著上升。 结论：AM在SiO2的刺激下，引起circZC3H4升高，继而通过结合miR-212调控ZC3H4的表达，升高的ZC3H4参与巨噬细胞活化以及下游成纤维细胞的迁移，上述通路的证实为矽肺肺纤维化的研究提供了新的思路以及潜在的诊疗靶点。

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