糖尿病小鼠缺血性卒中CNS表达PD-L1的靶向成像及阻断治疗的实验研究

摘要

本文主要分为以下几个部分: 第一部分 PD-L1-IR640B探针的合成及在野生组和糖尿病小鼠缺血性脑卒中模型中的近红外荧光成像研究 目的:合成PD-L1靶向性近红外荧光成像探针,并对所合成的目的探针进行活体和离体水平靶向性鉴定.利用分子影像学手段活体水平探测脑梗死区域及梗死周边区与目的探针特异性结合的PD-L1的表达情况,并对其表达水平进行定量分析. 方法：功能型抗PD-L1单克隆抗体与近红外荧光分子基团IR640B合成具有PD-L1靶向性的近红外荧光探针,并通过体外免疫荧光染色共定位等方法鉴定探针的靶向性.在卒中后的多个时间点将目的探针经尾静脉注入2型糖尿病小鼠及野生型小鼠体内,进行近红外荧光成像,观察脑梗死区的荧光信号强度变化.动物处死后,对离体脑、肝脏、心脏、肾脏、脾脏及双肺进行近红外光学成像,观察探针在各器官中的分布情况. 结果：活体近红外成像手段探测IR640B-PD-L1探针在缺血性卒中模型小鼠脑内的荧光信号强度及分布特点,结果显示探针经尾静脉注射6小时后,相较于对照探针,目的探针在缺血灶处的信号强度明显强于对侧相应区域.活体成像结果显示在卒中急性期及亚急性期,糖尿病鼠梗死区的荧光信号强度都明显高于野生组.体外成像测定脑组织及其它主要脏器组织荧光信号强度,结果显示IR640B在脑组织中的荧光信号强度远高于肝、肾脏等其它器官的荧光信号强度,同时肝脏及肾脏内荧光信号的大量聚集提示探针的排泄途径.免疫荧光共定位染色结果进一步说明近红外荧光成像分子探针具有良好的缺血脑组织靶向性. 结论：活体成像及体外免疫荧光共定位证实此近红外荧光分子探针具有高特异性和亲和力,可以活体探测梗死区域的PD-L1表达水平.糖尿病组小鼠卒中后脑内PD-L1表达量持续显著升高预示PD-L1在糖尿病伴发缺血性卒中预后过程中起重要作用. 第二部分 抗PD-L1单克隆抗体靶向治疗2型糖尿病小鼠缺血性脑卒中的实验研究 目的基于PD-L1的免疫调节作用在野生组缺血再灌注模型鼠体内的作用机制已被证实,本实验假设阻断PD-L1功能位点的方法亦是提高糖尿病卒中预后水平的重要治疗手段,并应用MRI、神经功能缺陷评分及WB等方法对抗PD-L1靶向治疗在糖尿病卒中预后中的作用进行进一步的探讨和验证. 方法：建立糖尿病小鼠和野生型小鼠缺血性脑卒中动物模型,在卒中后4h经尾静脉注射抗PD-L1抗体.于预定各时间点通过磁共振T2加权成像检测梗死灶大小,卒中后7d采用mNss评分量表及磁共振弥散张量成像评价抗体治疗组及对照组运动功能恢复情况,并采用WB方法测定炎症因子表达水平. 结果：卒中后第7天,磁共振T2加权成像证实两组抗PD-L1治疗组较同组对照组梗死范围更小.通过mNSS评分及DTI扫描发现两组治疗组在脑卒中亚急性期运动功能恢复及神经纤维完整性方面明显优于对照组,在卒中后第7天的时间点出现明显统计学差异.WB结果显示促炎因子(TNF-α)下调,抗炎因子(IL-10、IL-4)表达升高. 结论：抗PD-L1抗体能减小糖尿病鼠及野生组脑卒中后的梗死范围、改善行为学恢复情况及维持神经纤维完整性,并下调卒中相关的炎症反应水平.

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Abstract

缩略词表

前言

文献综述

一、脑卒中及其危险因素

二、糖尿病慢性炎症过程及并发症

三、协同刺激因子及淋巴细胞的增殖与活化

四、PD-1/PD-L 信号通路

五、小结和展望

第一部分 PD-L1-IR640B荧光探针的合成及缺血性脑卒中小鼠模型的近红外荧光成像研究

1.实验材料

1.1实验动物

1. 2实验试剂

1.3实验仪器与设备

2.实验步骤

2.1靶向PD-L1的近红外荧光探针的合成

2.2 2型糖尿病小鼠模型的建立

2.3局灶性缺血性脑卒中模型的建立[66]

2.4近红外荧光活体和离体成像监测梗死区PD-L1的表达及分布规律[66]

2.5 脑组织免疫荧光共定位法检测探针的靶向性

2.6统计分析

3.实验结果

3.1PD-L1靶向性近红外荧光探针的合成

3.2 PD-L1-IR640B探针的靶向性验证和近红外荧光成像

3.3 PD-L1-I近红外荧光探针的分布特点

4.讨论

5.小结

第二部分 抗PD-L1单克隆抗体靶向治疗2型糖尿病小鼠缺血性脑卒中的实验研究

1.实验材料

1.1实验动物

1.2实验试剂

1.3实验设备与仪器

2.实验步骤

2.12 2型糖尿病小鼠模型的建立

2.2局灶性缺血性脑卒中模型的建立

2.3实验分组

2.4神经功能缺陷评分[66]

2.5磁共振成像

2.6．Western Blot实验检测脑组织蛋白量表达水平

2.7统计分析

3.1磁共振T2加权成像（T2WI）评价梗死病灶体积变化

3.2神经功能缺陷评分（mNSS评分）

3.3磁共振弥散张量成像（DTI）评价梗死病灶神经纤维束的重塑情况

3.4 Western Blot法检测脑组织内炎症因子蛋白表达水平

3.5出血转化和死亡率

4.讨论

5.小结

全文总结

参考文献