星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道调节线粒体功能参与帕金森病的发生

摘要

本文从以下几个部分展开论述： 第一部分 星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD动物模型小鼠神经损伤中的作用 目的:应用星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除小鼠,研究星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD模型小鼠中脑神经损伤中的作用. 方法:应用3-4月龄Kir6.1loxp/loxp和Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+雄性小鼠,制备PD急性模型(①LPS急性PD模型:根据paximas和watson图谱定位中脑黑质坐标位点,注射5.0μg LPS②MPTP急性模型:腹腔注射MPTP20mg/kg,一日4次,两次之间间隔1小时).应用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)及离子钙结合蛋白l(ionized calcium-binding adapter molecule1,Iba-1)进行免疫组织化学染色,联合应用体视学计数法对小鼠中脑SNc区DA能神经元、星形胶质细胞和小胶质进行定量,评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对PD急性模型中脑神经损伤的影响.应用3-4月龄两基因型雄性小鼠,制备PD慢性模型(皮下注射MPTP,20mg/kg.1小时后腹腔注射丙磺舒,250mg/kg,3.5日一次,连续5周).应用转棒、爬杆和开场等行为学检测手段评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对MPTP/p所致小鼠运动功能的影响.分别应用TH免疫组化染色法、尼氏染色法,联合应用体视学计数法对小鼠中脑SNc DA能神经元数量进行定量;应用多巴胺转运体(dopamine transportor,DAT)免疫组化染色法对小鼠中脑SNc区、及纹状体DA能神经元数量及功能进行评价.应用GFAP、Iba-1进行免疫组织化学染色,联合应用体视学计数法对小鼠黑质区DA能神经元、星形胶质细胞和小胶质进行定量,评价中脑黑质区胶质细胞增殖活化情况. 结果:1)基础状态下,两种基因型小鼠中脑SNc区TH阳性神经元数目无显著性差异.LPS及MPTP急性模型制备后,两种基因型小鼠SNc区TH阳性神经元均显著性丢失,且Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠的丢失更为显著.2)基础状态下,两种因型小鼠中脑SNc区胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)数目无显著性差异.LPS及MPTP急性模型制备后,两种基因型小鼠SNc区胶质细胞均显著活化,且条敲组小鼠的胶质细胞增殖活化更为明显.3)MPTP在两种基因型小鼠的血浆、纹状体、肝、肾内代谢均无显著差异.4)MPTP/p慢性造模后,MAO-B在两种基因型小鼠的血清、中脑组织的酶活性无显著差异.5)基础状态下,两种基因型小鼠纹状体DA及其代谢产物水平无显著差异;MPTP/p慢性模型制备成功后,Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠纹状体内DA含量降低更为显著.另外无论是基础状态下还是MPTP/p模型,两种基因型小鼠纹状体的氨基酸类神经递质水平都无显著差异.6)MPTP/p慢性模型制备后,星形胶质细胞Kir6.1的缺失加重小鼠的运动协调能力障碍,但不影响小鼠的运动速度. 结论:1)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除加重PD动物模型加重中脑DA能神经元的丢失,促进星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖活化.2)星形胶质细胞Kir6.1基因敲除促进MPTP/p诱导的中脑内多种细胞应激反应.3)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD发生发展中发挥保护作用. 第二部分 星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道对线粒体功能的调节作用及其机制研究 目的:阐明星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在线粒体功能稳态中的作用及其机制 方法:应用出生3天内的两基因型新生小鼠,提取中脑原代星形胶质细胞进行离体培养.给予上述两种星形胶质细胞100μM MPP十刺激,收集细胞上清及细胞用于后续实验.应用DHE(Dihydroethidium,二氢乙啶)荧光探针检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞内ROS生成的影响.应用LDH试剂盒检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞LDH释放的影响.应用细胞免疫荧光、Western blot方法检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞凋亡的影响.应用Western blot检测MPP+对两种基因型星形胶质细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白水平和营养因子BDNF、GDNF、FGF2转录水平的影响.应用Western blot方法检测MPP+对两种基因型星形胶质细胞中炎症信号(P65、NLRP3、补体C3、Caspase-1)水平的影响.应用线粒体荧光探针MitoTracker Green进行染色,经流式细胞仪检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞线粒体数量的影响.应用线粒体荧光探针MitoTracker-Green、MitoDeep-red进行免疫荧光双标,通过流式细胞仪检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞线粒体膜电位的影响.应用线粒体荧光染料JC-1进行染色,通过细胞免疫荧光法及流式细胞仪检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞线粒体膜电位的影响.应用线粒体生成ROS的特异荧光探针Mito-SOX,通过细胞免疫荧光法及流式细胞仪检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞线粒体来源的ROS含量的影响.对TOM20及Kir6.1两种蛋白进行细胞免疫荧光双标,检测星形胶质细胞Kir6.1的分布及在线粒体上的表达情况.应用MPP+刺激离体培养的两种基因型小鼠中脑原代星形胶质细胞,结合工具药线粒体K-ATP通道的特异阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)、开放剂二氮嗪(Diazoxid),检测线粒体的ROS及线粒体的膜电位变化,结合ELISA检测上述不同处理组的细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β三种炎症因子的变化.应用分子克隆技术扩增并纯化GFP-LC3及mitoDSRed2质粒,共转染体外培养的两种基因型的原代星形胶质细胞,通过细胞免疫荧光检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞线粒体自噬的影响. 结果:1)MPP+刺激引起原代星形胶质细胞ROS释放增多,Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠中脑原代星形胶质细胞的ROS增加更为显著.2)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失促进MPP+诱导的原代星形胶质细胞的LDH的释放.3)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失加重MPP+诱导的原代星形胶质细胞的凋亡.4)星形胶质细胞Kir6.1基因缺失,显著上调IL-1β、TNF-α的蛋白水平.5)星形胶质细胞Kir6.1基因缺失促进星形胶质细胞中炎症信号通路(P65、补体C3、Caspase-1)的激活.6)MPP+刺激引起原代星形胶质细胞线粒体数量增多,Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠的星形胶质细胞的线粒体数量增加更为明显. 结论:1)星形胶质细胞Kir6.1基因缺失加剧MPP+引起的星形胶质细胞损伤、线粒体功能损伤及炎症反应的上调.2)星形胶质细胞尤其是线粒体Kir6.1/K-ATP通道缺失抑制线粒体自噬,加重MPP+引起的线粒体功能紊乱,促进原代中脑DA能神经元的损伤.3)星形胶质细胞在MPP+诱导的星形胶质细胞线粒体自噬的调节中发挥重要作用. 综上所述,本文工作的主要创新之处在于: 创新之处 1、揭示星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD神经损伤中发挥重要作用. 本研究应用星形胶质细胞Kir6.1条件敲除小鼠,制备PD急性和慢性模型,发现星形胶质细胞Kir6.1基因缺失加重小鼠PD急性和慢性模型中DA能神经元丢失和胶质细胞增殖活化的现象.其机制涉及自噬反应的抑制,内网应激反应、炎症反应、凋亡信号的激活.结果表明星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道是参与PD发生发展过程中具有重要作用的靶点. 2、阐明星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道通过调节线粒体自噬维持星形胶质细胞线粒体功能参与PD发生发展的分子机制. 本研究揭示,星形胶质细胞Kir6.1基因缺失加剧MPP+所致星形胶质细胞的损伤及线粒体功能的损伤,诱导了星形胶质细胞的炎症反应,加剧DA能神经元损伤.并进一步阐明星形胶质细胞尤其是线粒体上的Kir6.1/K-ATP通道参与调控线粒体自噬,调节星形胶质细胞线粒体功能发挥保护作用.为研发靶向于星形胶质细胞线粒体功能调节的神经保护剂提供了新的靶标.

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