牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的原核表达

摘要

牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)寄生于牛体内引起的一种血液原虫病。近些年，瑟氏泰勒虫病的发生呈上升趋势，且疫区内本病的发病率和致死率均较高，给相关国家的畜牧业带来了较大的经济损失，引起了国内外兽医界的广泛关注。牛瑟氏泰勒虫(T.sergenti)P33蛋白是T. sergenti的主要虫体表面蛋白之一，具有很好的免疫原性。牛瑟氏泰勒虫(T. sergenti)P33主要表面蛋白基因序列中的c末端有疏水的膜固着点，N末端有信号肽序列。 本研究根据GenBank牛瑟氏泰勒虫P33主要表面蛋白基因设计了一对引物，利用全血基因组DNA提取试剂盒提取了牛瑟氏泰勒虫全血基因组DNA，用PCR技术扩增和克隆了大小为786 bp的P33主要表面蛋白基因的部分片断，对所克隆的P33基因序列与基因库中已发表的序列进行比较分析。结果表明同源性达99％，证明该基因片段确为牛瑟氏泰勒虫P33主要表面蛋白基因。将P33主要表面蛋白基因与pET-28a(+)载体进行连接，经酶切鉴定和PCR鉴定，证明成功构建了含有目的基因片段的原核表达载体pET-28a-P33。然后将构建好的原核表达载体pET-28a-P33，在1m mol/L的IPTG诱导下，在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态中得到了高效表达，当4 h时表达量达到高峰。所表达出来的P33融合蛋白分子量约为30.3 ku，其表达量占菌体总蛋白的43％，以包涵体形式存在，并对所表达蛋白进行了western blotting检测。结果，该蛋白可被牛瑟氏泰勒虫阳性血清识别，表明该融合蛋白具有较好的反应原性。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1材料

1.1血液来源

1.2菌种和载体

1.3试剂

1.4主要仪器

1.5主要试剂的配制

1.6主要培养基的配制

2方法

2.1引物设计与合成

2.2牛瑟氏泰勒虫基因组DNA的提取

2.3P33基因片断的PCR扩增

2.4 P33基因的克隆与阳性重组质粒的鉴定

2.5核苷酸序列的测定及分析

2.6原核表达载体的构建(构建流程图见附录)

2.7重组质粒在大肠杆菌中的表达及鉴定

3结果

3.1 PCR结果

3.2重组质粒的鉴定

3.3核苷酸序列的测定及分析

3.4原核表达载体的构建

3.5原核表达与鉴定

4讨论

5结论

参考文献

致谢

作者简介

附录