延边黄牛体细胞克隆卵母细胞显微操作方法的研究

摘要

试验目的：以延边黄牛为研究对象，探求一种操作简便、低损伤、去核准确的去核方法，同时确立一种适合延边黄牛体细胞克隆的卵母细胞注核方法，从而为体细胞克隆整体效率的提高打下基础。 试验方法：通过两种不同的卵母细胞去核方法的去核比较，试验结果以操作时间效率、卵裂率和发育率来评定，从而验证挤压法的可靠性和可行性。同时对使用此去核方法的去核最佳时间、最佳去除细胞质数量以及确立最佳的注核方法进行研究。 试验结果： 1．在两种不同去核方法的比较试验中，将Willadsen去核法进行了改进——挤压法，无论在去核操作时间上(41s/枚)，还是在去核效率(80.70％)上都显著地优于盲吸法(76s/枚、65.00％，P<0.05)；此外，使用盲吸法去核的卵母细胞卵裂率为44.15％，而挤压法(改进的Willadsen法)的卵裂率为51.40％，两者之间差异不显著(P>0.05)，从而创立出一种较适合延边黄牛体细胞克隆的去核方法——挤压法。 2．为了进一步确定挤压法的最佳去核时间，通过Hoechst33342染色、荧光显微镜的观察，试验结果显示，延边黄牛卵母细胞随体外成熟培养时间的延长，核与极体之间距离有变大的趋势。这就使以极体为标志去核率随成熟培养时间的延长而下降。本试验确定出适合挤压法的最佳去核时间为20～22h。 3．在确定去除细胞质数量的试验中，去除细胞质数量为1/3和1/4(82.54％和81.05％)时的去核率显著高于去除1/5组(64.75％)，试验结果看出随着去除细胞质数量的增多，去核率有增高的趋势，但对重组胚的后期发育不利，由表8可以确定去除最佳数量的细胞质为总量的1/4～1/3；而在卵母细胞去除不同的细胞质数量对重组胚卵裂率、发育率的影响试验中，实验结果显示，与另两组相比，去除1/4细胞质组的卵裂率、4-Cell发育率是最高的，分别为41.68％、70.32％(P<0.05)。综合以上试验结果，从而确立去除1/4总量的细胞质是最佳的。 4．在研究卵母细胞注核方法试验中，电融合法注核与细胞浆内注射法相比，在注核显微操作时间效率、卵裂率、4-Cell发育率上，电融合法组分别为53s/枚，43.65％，56.39％(P<0.05)，与细胞浆内注射法组(77s/枚，18.69％，17.50％)之间存在显著差异(P<0.05)，从而确定电融合法是一种适合延边黄牛体细胞克隆的有效注核方法。 5．在试验六中，由试验结果显示注核操作液中添加0.1％PVA对核移植卵裂率、发育率与对照组相比(49.34％，63.16％和52.14％，61.67％)(P>0.05)无显著影响。表明注核操作液中添加PVA并没有起到提高延边黄牛的核移植效果作用。 试验结论：在延边黄牛体细胞克隆卵母细胞显微操作方法研究试验中，挤压法是一种操作的快速、简单、实用的去核方法；同时，带下注射法(电融合法)是一种适合延边黄牛体细胞克隆的有效的注核方法。

目录

文摘

英文文摘

第一章绪论

1.1试验研究的意义

1.2哺乳动物体细胞克隆的研究进展

1.3哺乳动物卵母细胞的去核方法简介及优缺点

1.4影响体细胞克隆卵母细胞核移植效率的因素

1.5克隆技术的应用前景及其存在的问题

第二章、材料与方法

2.1.试验材料

2.2试验方法

2.3试验设计

2.4数据统计方法

第三章、结果与分析

3.1不同去核方法对延边黄牛卵母细胞去核率、去核操作时间、卵裂率及发育率的影响。

3.2不同体外成熟时间的卵母细胞对卵母细胞核与极体位置关系影响

3.3卵母细胞不同卵龄时去核对去核率的影响

3.4去除不同数量的细胞质对去核率以及重组胚发育率的影响

3.5不同的注核方法对显微操作时间效率、卵裂率及发育率的影响

3.6不同注核显微操作液对重组胚卵裂率及发育率的影响

第四章、讨论

4.1延边黄牛卵母细胞不同去核方法对去核准确率、去核操作时间、卵裂率及发育率的影响。

4.2不同体外成熟时间对卵母细胞核与极体位置关系影响

4.3卵母细胞不同卵龄时去核对去核率的影响

4.4去除不同的细胞质数量对去核率、卵裂率及发育率的影响

4.5不同的注核方法对显微操作时间效率、卵裂率及发育率的影响

4.6不同注核显微操作液对重组胚卵裂率及发育率的影响

第五章、结论

参考文献

致谢

附录