延边黄牛D型产气荚膜梭菌抗原提纯及分析

摘要

产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）是一种梭状芽孢属条件性致病菌，广泛分布于自然界，遍布世界各地，同时也是肠道中的常在菌群之一，在一定条件下，可引起相关的各种严重疾病。吉林省延边地区是产气荚膜梭菌病的高发区，导致延边黄牛猝死频繁发生，对延边黄牛的危害极为严重，造成巨大的经济损失。
　　本试验为研究延边黄牛 D型产气荚膜梭菌的抗原特性，提取经纯培养的D型产气荚膜梭菌菌体及其分泌的毒素，菌体经超声波裂解制备成粗提体抗原，毒素经饱和硫酸铵处理制备成粗提分泌抗原，再分别经过Sephadex G-200分离纯化后，应用十二烷基硫酸钠-聚炳烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及免疫印迹（Western blotting）对D型产气荚膜梭菌粗提及纯化的体抗原和分泌抗原进行反应原性分析。结果表明，D型产气荚膜梭菌的体抗原有四条主要蛋白带，其分子量分别为176kD、140kD、116kD、100kD，其中特异性蛋白分子量为140kD；分泌抗原有三条蛋白带，其中特异性蛋白分子量为43kD、35kD。
　　将纯化的特异性菌体及分泌抗原加入佐剂，免疫小鼠（0.1mg/只），并设对照组，利用琼脂扩散试验（AGP），对纯化的特异性蛋白抗原进行免疫原性分析。结果显示，特异性菌体抗原产生的抗体效价最高达到1:64，比全菌抗原产生的效价高；特异性分泌抗原产生的抗体效价最高达到1:32，比细菌培养上清液产生的效价高。说明纯化的特异性抗原具有良好的免疫原性。
　　本研究确定了延边黄牛D型产气荚膜梭菌的体抗原和分泌抗原具有较好的反应原性和免疫原性，为以后血清学诊断方法的建立及疫苗的研制提供理论依据。

目录

声明

引言

1 病原体及毒素介绍

2 产气荚膜梭菌病在国内外流行情况

3 产气荚膜梭菌病诊断方法研究进展

4 产气荚膜梭菌病的治疗及预防

5 近些年来产气荚膜梭菌感染对人类的危害

6 本课题的研究目的及意义

材 料 与 方 法

1 材 料

1.1细菌鉴定及培养所用材料

1.2抗原提取所用材料

1.3 SDS-PAGE及Western blotting所用材料

1.4免疫原性分析所用材料

1.5主要仪器

2 方 法

2.1 D型产气荚膜梭菌培养

2.2 D型产气荚膜梭菌体抗原的提纯及分析

2.3 D型产气荚膜梭菌分泌抗原的提纯及分析

2.4 D型产气荚膜梭菌抗原的免疫原性分析

结果

1 产气荚膜梭菌鉴定及培养

1.1 液体培养基培养物镜检

1.3 液体增菌培养基培养

1.4 D型产气荚膜梭菌生长曲线及pH值变化曲线

2 产气荚膜梭菌体抗原的提纯及分析

2.1 产气荚膜梭菌体抗原的纯化

2.2 菌体抗原SDS-PAGE分析

2.3 菌体抗原免疫印迹分析

3 产气荚膜梭菌分泌抗原的提纯及分析

3.1 产气荚膜梭菌粗提分泌抗原的纯化

3.2 分泌抗原的SDS-PAGE分析

3.3 分泌抗原的Western blotting分析

4D型产气荚膜梭菌免疫原性分析

4.1 D型产气荚膜梭菌体抗原的免疫原性分析

4.2 D型产气荚膜梭菌分泌抗原的免疫原性分析

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

附 录（在读期间发表论文）