自制多器官保存液对家兔肾低温保存的实验研究

摘要

研究背景：
　　器官保存是移植的三大技术之一，为了缓解器官短缺的矛盾和不断提高患者存活率，移植临床对器官保存技术提出了更高的要求。单纯静态低温保存仍然是最简单和常用的器官保存方法，单纯低温保存中常使用器官保存液包括HTK（Histidine-Ketoglutarate）、Cesiior液和UW（Universityof Wisconsin）液。其中UW液可以成功保存犬肾在72小时以上，保存肝脏在30小时左右，是器官保存液的金标准，但是其成分复杂、价格昂贵，配方存在两高问题：高钾、高粘滞度，而且使用中暴露出一些缺点，不能完全适应临床需要。
　　国内目前大器官移植、多脏器联合移植迅速开展，但是迄今还没有成功研制出国产长效多器官保存液，无法满足日益增长的移植临床需要。实现多器官保存液的国产化是我国器官保存研究的重点，因此我们在吸收国内外器官保存液的优点的基础上，配制了AMU多器官保存液，并通过观察离体家兔肾低温保存期间皮质形态学情况，氧自由基损伤情况，以及间接测定保存期间肾皮质细胞的能量代谢，研究其对家兔肾脏的低温保存效果。
　　实验目的：
　　1．配制AMU多器官保存液，确定自制多器官保存液配方成分和含量。AMU以磷酸盐作为能力强大的缓冲系统，能够有效抑制低温缺氧环境条件下细胞和组织酸化。谷胱苷肽（还原型）、异搏定和 MgCl2可以减轻低温缺血导致的线粒体功能损伤、抑制细胞内钙超载和氧自由基损伤，减轻缺血冷损伤，从而延长保存时间；以ATP-MgCl2的形式提供了外源性ATP，使其更易透过细胞膜，提高了多种脏器移植后的生存能力和移植前组织内的ATP含量，有助于低温保存期间维持细胞能量代谢；尿激酶通过抗栓和溶栓作用，保证保存器官的微循环。
　　2．建立家兔离体肾脏单纯低温保存模型，在低温保存的各时间点，对光镜和电镜下的肾皮质细胞的肿胀、线粒体的肿胀、胞质空泡化，基底膜裸露、小管水肿、坏死等形态学指标进行描述性研究，比较不同保存液保存期间皮质显微结构和超微结构变化，特别是线粒体在低温保存中的损伤程度。
　　3．检测低温保存中肾皮质匀浆脂质过氧化产物（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的改变，研究在低温保存的各时间点，组织细胞受自由基攻击的严重程度和不同保存液清除氧自由基的能力。
　　4．能量代谢间接测定：在低温保存的各时间点，分离得到肾皮质线粒体，检测线粒体功能的改变，主要包括线粒体呼吸控制率（RCR）和磷氧比（ADP/O），借此反应保存期间呼吸链的整体活性和细胞氧化磷酸化生成 ATP的效率。离体兔肾低温保存期间，检测肾皮质Na+-K+ATPase活力的改变。上述实验间接反映不同保存液对低温保存肾脏能量代谢的保护作用，同时把低温缺氧损伤后不同保存液皮质线粒体的形态变化和功能变化联系起来研究。
　　实验方法：
　　1．AMU多器官保存液配制：AMU液仍然以磷酸盐为缓冲系统，以ATP-MgCl2的形式提供了外源性ATP，使其更易透过处于缺血、缺氧状态的细胞膜，且ATP-Cl2与腺苷对缺血再灌注肾脏的保护作用基本相同；去掉了UW液内极昂贵的羟乙基淀粉和较贵的棉食糖，用临床效果可靠而价格低廉的低分子右旋糖酐-60、蔗糖替代，能够降低灌注液的粘滞度，有利于各种脏器的原位灌注；添加了钙离子拮抗剂异博定，防止出现保存组织中钙超载和保持内环境的稳定；添加了分子量较大的抗血栓剂尿激酶，用尿激酶的抗栓和溶栓作用，以及低分子右旋糖酐-60的药理作用，保证保存器官的微循环；设计渗透压为343±5mOsm/L,pH值为7.4±0.1左右。配制完成后，500ml聚乙烯塑料包装。采用高温高压消毒。生产出的AMU保存液是澄清、无色、透明、无菌溶液。（该项工作由延边医院制剂室负责完成）。
　　2．建立家兔离体肾脏单纯低温保存模型：按无菌手术原则进行术前准备，氯胺酮2mg/kg经耳静脉注射麻醉家兔。腹部正中切口，切除前给予肝素3mg/Kg，在髂血管分叉处上方约1cm处游离腹主动脉和下腔静脉，主动脉剪开一小口，向上置入灌注管，在置管下方结扎阻断腹主动脉；在肾动脉上方结扎向上的腹主动脉之后，开放灌注管分别以0-40CAMU液和对照组保存液UW液或HCA液进行肾脏的灌注，灌注压100cmH2O，灌至肾脏变苍白；分别切除双肾，立即浸入冰生理盐水中降温，浸入无菌的相应0-40C保存液中保存。在家兔肾保存的0、24、48、72、96小时切取肾皮质标本，按光镜或电镜标准制备标本，对光镜和电镜下的肾脏皮质细胞的水肿、胞质空泡化、肾小管坏死、线粒体水肿、嵴破坏等形态学指标进行描述性研究，比较不同保存液组肾皮质显微和超微结构变化，特别是线粒体在低温保存中的损伤程度。
　　3．在兔肾保存的24、48、72小时切取肾皮质标本，肾皮质1％匀浆进行马斯亮兰法蛋白定量后，应用硫代巴比妥酸法（TBA法），根据公式测定皮质1%匀浆中MDA含量，应用黄嘌呤氧化酶法测定肾皮质1%匀浆，根据公式测定SOD酶的活性。
　　4．检测肾皮质线粒体功能的改变，主要指标包括线粒体呼吸控制率和磷氧比。在家兔肾低温保存的各时点，取皮质标本（1.5g），匀浆器冰水浴中进行电动匀浆。应用低温高速离心机，差速离心法分离得到皮质线粒体悬液，双缩脲法测定其蛋白含量；平衡记录仪描记四态呼吸曲线（使用琥珀酸和ADP作为反应底物），并计算呼吸Ⅲ态、Ⅳ态耗氧速率、线粒体呼吸控制率和磷氧比，观察低温缺血对线粒体功能的损伤及AMU液组和HCA液组中线粒体整体功能和氧化磷酸化效率的变化及差异。
　　5．在兔肾保存的24、48、72小时切取肾皮质标本，肾皮质制成2%的匀浆，进行考马斯兰法蛋白定量后，按试剂一:试剂二:试剂四:试剂六=130:40:40:的比例配制混合液，酶促反应后定磷，根据公式计算Na+-K+ATPase活力。
　　结果：
　　1．光镜和电镜病理检查结果。发现AMU液组和UW液组病理改变在各个时病变程度无明显差异。光镜下两组保存24小时肾小球、肾小管结构基本完整，肾小管上皮细胞少量肿胀变性；48小时后肾小球结构基本正常，肾小管上皮细胞小灶状坏死和小管上皮细胞水肿较明显，上皮细胞核轻度固缩，刷状缘部分脱落，基底膜裸露，髓质部间质轻度水肿。72小时后上述病变进一步加重，肾小管上皮广泛且严重的浑浊变性，部分细胞破碎、坏死。96小时后上述病变更加重，但AMU液组病变程度较UW液组为重。电镜所见，保存24小时，AMU液组、UW液组细胞核改变、线粒体肿胀相似。AMU液组和UW液组保存48小时核略变形，核质边聚，线粒体多数肿胀，嵴减少；72小时后细胞核变形、核质固缩，线粒体严重肿胀、破裂；96小时后AMU液组电镜下病变明显比UW液组重。以上说明AMU液保存72小时时形态学方面与UW液大体相当，保存96小时时AMU液组病变明显重于UW液组。
　　2．低温保存期间，实验AMU液组和对照HCA液组肾皮质SOD活性均出现明显降低趋势。低温保存24小时，AMU液组SOD活性与HCA液组比较，无显著性差异（p＞0.05）,但保存48小时至72小时后，SOD活性明显高于HCA液组，有显著性差异（p＜0.05）；随着低温保存时间的延长，AMU组和HCA组肾皮质MDA含量逐渐增加。AMU液组肾皮质MDA含量在各时间点显著高于HCA液组，具有明显差异（p＜0.05）。以上说明在减轻氧自由基损伤方面优于HCA液。
　　3．线粒体活性改变。随着低温保存时间的延长，AMU液组和HCA液组肾皮质线粒体呼吸Ⅲ态耗氧速率和线粒体呼吸控制率、磷氧比下降。除24小时外，其余时点AMU液组肾皮质线粒体呼吸Ⅲ态耗氧速率均高于HCA液组，两组间差异明显（p＜0.05）；低温保存期间AMU液组和HCA液组的Ⅳ态耗氧速率均有轻度的升高，多数时点AMU液组和HCA液组间无明显差异（p＞0.05）；但保存72小时后，AMU液组显著高于HCA液组（p＜0.01）；低温保存的各时点ADP/O2，保存24小时，AMU液组和HCA液组无显著性差异（p＞0.05），48小时后，AMU液组明显高于HCA液组，存在显著性差异（p＜0.05）。以上说明AMU保存液在保持线粒体整体功能和氧化磷酸化生成ATP的效率显著高于HCA保存液。
　　4．随着低温保存时间的延长，AMU液组和HCA液组肾组织Na+-K+ATPase活性逐渐下降。保存24小时和48小时，AMU液组与HCA液组无明显差异（p＞0.05）；保存72小时，AMU液组Na+-K+ATPase活性明显高于HCA液组，存在明显差异（p＜0.05）。以上说明AMU保存液在减缓Na+-K+ATPase活性下降方面显著优于HCA保存液。
　　结论：
　　AMU液保存的家兔肾在保存至72小时为止，皮质形态学改变方面与UW保存液相似，两组间无明显差异；保存96小时时，AMU保存液病变程度较UW保存液为重；在氧自由基损伤、能量代谢方面，大部分指标AMU液组均比HCA液组好，两组间存在明显差异。家兔离体肾脏单纯低温保存的病理和生化功能的研究结果提示，AMU液对肾脏皮质低温缺血损伤的保护效果比HCA液好，而与UW液的对肾脏皮质保护效果相似，AMU液并不亚于UW液。而且AMU液配方中去掉了UW液中极昂贵的羟乙基淀粉和较贵的棉食糖，代之以临床效果可靠而价格低廉的低分子右旋糖酐-60和蔗糖，大部分为国产原料，必然大大降低生产成本及价格。AMU液改进了UW液的高钾、高粘滞度的缺点；且配方简单，使用方便，因此更具有临床应用前景。

目录

声明

英文缩略词

引言

第一部分 多器官保存液（AMU）的配制和对家兔肾脏低温保存的形态学研究

实验一、AMU多器官保存液的配制

第一章 AMU多器官保存液配方

第二章 讨论

实验二、家兔离体肾脏单纯低温保存期间形态学改变

第一章 实验材料

第二章 实验方法

第三章 结果

第四章 讨论

第五章 结论

附图

参考文献

第二部分：AMU保存液对兔肾低温保护生化学研究

实验一、低温保存期间肾皮质中丙二醛（MDA）、超氧化歧化酶(SOD)测定

第一章 原理及意义

第二章 实验材料

第三章 实验方法

第四章 结果

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

实验二、低温保存期间肾皮质线粒体功能的测定

第一章 测定的原理

第二章 实验材料

第三章 实验方法

第四章 结果

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

实验三 低温保存期间肾皮质Na+-K+ATPase的检测

第一章 测定原理及意义

第二章 实验材料

第三章 实验方法

第四章 结果

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

全 文 总 结

综述:多器官保存液的研究进展

致谢

附录：（攻读学位期间发表论文目录）