新型抗原传递载体在抗弓形虫病疫苗上的初步应用

摘要

弓形虫（Toxoplasmagondii）是顶复门原虫，可感染各种哺乳动物，包括人和鸟类。弓形虫是一种机会致病性原虫，健康人群感染弓形虫通常无症状，对于免疫缺陷人群例如艾滋病患者可导致严重的弓形虫病。弓形虫在畜禽中传播、流行，导致畜禽大批死亡，给畜牧业造成重大的经济损失。弓形虫病的根本防治手段是研制行之有效、使用方便的疫苗，目前已经鉴定出多种疫苗抗原分子，如SAG1、AMA1和GRA4等。TAT是艾滋病病毒（HIV-1）的反式转录激活催化剂，HIV-1 TAT蛋白转导域（TAT-PTD）是目前研究比较透彻的细胞渗透肽之一，已经成功地携带多肽、荧光标记蛋白、DNA及小分子药物等，实现体内外的跨膜递送，而且发现用 TAT融合蛋白免疫小鼠后,经组织相溶性树突状细胞的抗原提呈,可以激发抗原特异性细胞毒性T细胞效应。
　　本试验应用pET28a载体分别构建了细胞渗透肽TAT与三种弓形虫抗原和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒，即pET28a-TAT-SAG1、pET28a-TAT-GRA4、pET28a-TAT-AMA1、 pET28a-TAT-EGFP质粒。重组质粒被转化到大肠杆菌中并通过 IPTG诱导，成功进行了融合表达。表达产物经 IDA His·Bind树脂纯化后,进行SDS-PAGE和Western blotting分析，结果得到31KDa的TAT-EGFP融合蛋白、34KDa的TAT-SAG1融合蛋白、38KDa的TAT-GRA4融合蛋白、62KDa的TAT-AMA1融合蛋白，感染弓形虫的小鼠血清可特异性的识别融合TAT的SAG1、GRA4蛋白和微弱的识别TAT-AMA1蛋白。将TAT-EGFP蛋白转导体外培养的Vero细胞，通过观察荧光验证了TAT-EGFP可渗透到Vero细胞中。
　　最后应用纯化后的融合蛋白(TAT-EGFP，TAT-SAG1，TAT-GRA4，TAT-AMA1，SAG1，GRA4，AMA1)免疫BALB/c小鼠，应用间接ELISA检测体液免疫水平，结果表明 TAT没有增强疫苗的体液免疫水平。在三免一周后,每只小鼠攻1000只PLK/GFP弓形虫，观察30天小鼠存活情况。结果TAT-SAG1免疫组小鼠获得了50％的存活率，其它组别小鼠未获得较好的免疫保护。

目录

声明

前言

1.弓形虫病概况

2 佐剂在弓形虫疫苗上的应用

3 细胞渗透肽的种类

4 细胞渗透肽在动物疫苗方面的应用

5 本实验的研究目的及意义

材料与方法

1材料

2 方法

结果

1弓形虫PLK/GFP株的体外培养

2 目的基因的扩增

3 重组质粒pET28a-TAT的PCR鉴定

4 重组质粒pET28a-TAT-EGFP的PCR及酶切鉴定

5 弓形虫特异性抗原基因重组质粒的PCR及酶切鉴定

6 重组质粒的序列测定

7 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及表达形式的优化

8 融合蛋白的纯化

9 TAT-SAG1、TAT-GRA4、TAT-AMA1、SAG1、GRA4、AMA1蛋白的复性

10弓形虫特异性基因表达产物的Western blotting 分析

11 标准BSA比对检测融合蛋白浓度

12 TAT-EGFP融合蛋白的穿膜活性分析

13间接ELISA检测体液免疫水平

14 免疫保护性试验结果

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

在研期间发表的论文