气肿疽nanA与fliA融合基因亚单位疫苗的制备及免疫效果评价

摘要

为了制备安全且有效的气肿疽新型疫苗，控制气肿疽的暴发，本研究建立了气肿疽的原核表达载体，制备了气肿疽融合基因亚单位疫苗和单基因亚单位疫苗，并对两种疫苗的免疫水平进行了评价。
　　本研究根据已报道的气肿疽梭菌的fliA和nanA基因设计两对特异性引物，以气肿疽梭菌基因组DNA为模板，扩增出两段大小分别为429 bp的fliA基因片段和1113 bp的nanA片段。利用SOE-PCR串联两个片段，在引物中加入了柔性Linker，得到大小约为1587 bp的融合基因，并将该融合基因和鞭毛基因分别与pMD18-T Simple载体连接，转化至大肠杆菌感受态DH5α中，获得克隆载体pMD18-fliA和pMD18-fliA-nanA。继而对克隆载体进行双酶切，获得带有黏性末端的fliA片段和fliA-nanA片段,与具有相同黏性末端的pEGX-4T-1原核表达载体进行连接，将连接后的质粒转化至大肠杆菌感受态BL21中，从而构建出了重组质粒pEGX-4T-fliA-nanA和pEGX-4T-fliA原核表达载体。对重组质粒pEGX-4T-fliA-nanA和pEGX-4T-fliA进行双酶切鉴定、PCR鉴定、及序列测定后，将三项鉴定均为阳性的克隆使用IPTG进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳可见大小约83 kDa大小的片段，和42 kDa大小的片段，进行western-blotting可见目的条带有反应原性。将蛋白进行纯化后对小鼠进行免疫。使用间接ELISA对小鼠的体液免疫进行测定。使用细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的ELISA检测试剂盒对小鼠的细胞免疫水平进行测定。
　　研究结果表明，FliA(C)蛋白与FliA(C)-NanA融合蛋白均能使小鼠产生体液免疫应答，在相同免疫剂量下，融合蛋白组的体液免疫水平明显高于鞭毛蛋白组，该结果表明，神经氨酸酶对鞭毛蛋白的免疫原性有增强的作用。融合蛋白比鞭毛蛋白可以更快诱导机体产生IL-2、IFN-γ。IL-4检测结果表明，融合蛋白与鞭毛蛋白在该反应中相差不大，只是融合蛋白加快了IL-4的产生速度。本研究成功制备了气肿疽NanA-FliA(C)亚单位疫苗。

目录

声明

前言

1.1 气肿疽简介及研究进展

1.2 气肿疽梭菌鞭毛蛋白简介

1.3 气肿疽梭菌神经氨酸酶简介

1.4气肿疽疫苗研究进展

1.5 本研究的目的及意义

材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

结果

3.1气肿疽梭菌的革兰氏染色

3.2气肿疽梭菌的血液琼脂平板菌落

3.3目的基因的扩增

3.4重组质粒的PCR鉴定

3.5 重组质粒的双酶切鉴定

3.6 重组质粒的序列测定

3.7 重组表达载体的PCR鉴定

3.8 重组表达载体的酶切鉴定

3.9表达蛋白SDS-PAGE电泳图

3.10蛋白免疫印迹分析

3.11蛋白存在形式鉴定

3.12纯化蛋白鉴定

3.13 体液免疫水平检测

3.14细胞免疫水平检测

讨论

结论

致谢

作者简介

参考文献