延边株气肿疽梭菌pVAX1-FliA核酸疫苗的制备及免疫效果评价

摘要

气肿疽由气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)引起，是芽孢革兰氏阳性细菌，对牛、羊造成破坏的一种致命性疾病，有孢子污染的草场放牧的反刍动物皆易感染。常见的临床患病部位多见肌肉丰满处，引起炎性、气性坏疽，触压有捻发音等临床症状，能够引起组织毒性缺氧，是牛羊的一种高死亡率疾病。除了反刍动物，其他动物很少感染。放牧的新生反刍动物对气肿疽最敏感。气肿疽可存在于流行地区的土壤和粪便中。一旦牧场受到严重污染，易感动物感染病例一般每年都发生。目前延边州地区发生多起病例，形势严峻，使黄牛养殖户及人民财产受到不小的损失，潜在的危害到人的安全生产，急需对该病采取有效的防控措施。
　　本研究根据GenBank气肿疽鞭毛基因（登录号: AB058932）的参考序列，设计一对可扩增完整开放阅读框的特异性引物扩增出延边株气肿疽FliA基因，将PCR扩增的长度为1267bp的FliA连接至克隆载体，对克隆的pMD-19t-FliA质粒进行测序分析，将测序分析正确的质粒上的目的基因，连接至真核表达载体，把鉴定正确的pVAX1-FliA表达质粒转染至Vero细胞中，运用FITC检测技术检测FliA基因在Vero细胞中的表达产物。之后通过质粒大提试剂盒对pVAX1-FliA重组质粒进行质粒大提，制备出延边株气肿疽鞭毛基因核酸疫苗。应用制备的核酸疫苗，按照pVAX1-FliA真核表达质粒实验组及pVAX-1空载体对照组、PBS对照组对BALB/c小鼠进行免疫接种。通过间接ELISA检测IgG、IgG1及IgG2a抗体水平;通过间接ELISA试剂盒检测IL-4和IFN-γ细胞因子水平。
　　结果显示，扩增的气肿疽FliA基因片段为1267 bp，测序结果与NCBI上的6个基因型比对，核苷酸序列同源性为93％～100％，与德国株12S0467核苷酸序列同源性达到100％。构建的pVAX1-FliA真核表达质粒可在哺乳动物真核细胞内稳定表达。pVAX1-FliA肌肉注射，免疫过的小鼠可以产生体液免疫应答和细胞免疫应答。
　　该研究对延边地区本地分离株的鞭毛抗原基因进行测序和分析，对本地区黑腿病的防控工作提供参考，为本地株以鞭毛蛋白基因为抗原的DNA疫苗奠基了扎实的基础。为了对延边地区黑腿病的有效控制，制备低毒安全的pVAX1-FliA核酸疫苗，通过免疫小鼠，对该疫苗的免疫效果进行了评估。

目录

声明

摘要

前言

2 培养特性

3 流行病学

4 临床症状及病理变化

5 诊断

5．1 血清学诊断方法

5．2 分子生物学诊断方法

6 防控

7 主要抗原

7．1 鞭毛蛋白

7．2 唾液酸酶

7．3 细胞毒素

7．4 其他毒力因子

8 研究进展

8．1 生物信息学研究进展

8．2 免疫学研究进展

9 研究目的与意义

材料与方法

1．5 酶与主要试剂

1．6 主要设备仪器

1．7 主要配制试剂

2 方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 气肿疽梭菌的培养

2．3 气肿疽梭菌DNA的提取

2．4 延边株气肿疽FliA基因的扩增

2．5 PER产物的纯化

2．6 延边株气肿疽FliA基因的克隆

2．7 重组pVAX1-FliA质粒的构建

2．8 重组质粒pVAX1-FliA的大量提取

2．9 Vero细胞的传代培养

2．1 0 重组真核表达质粒pVAX1-FliA的表达

2．1 1 动物免疫试验

2．1 2 小鼠血清中免疫水平的检测

2．1 4 小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平检测

结果

2．2 重组质粒pMD 19-T-FliA的双酶切鉴定

3 FliA基因克隆产物的序列测定及分析

3．1 FliA基因核苷酸及氨基酸全序列的比对分析

3．2 FliA基因核苷酸的遗传进化树分析

3．3 鞭毛蛋白FliA的理化性质分析

3．4 鞭毛蛋白FliA的二级结构预测

3．5 鞭毛蛋白FliA的三级结构分子模型

4 重组表达质粒pVAX1-FliA的鉴定

5 pVAX1-FliA质粒中FliA基因表达的鉴定

5．1 IFAT检测FliA基因的表达

6 BALB／c小鼠血清的特异性抗体含量检测结果

6．1 IgG检测结果

6．2 IgG1测定结果

6．3 IgG2a测定结果

7 外周血中细胞因子程度检测

7．2 IFN-γ测定结果

讨论

结论

参考文献

致谢

附录