基于PEG化透明质酸的二氯化铂靶向纳米胶束的制备及其对肺癌模型的作用研究

摘要

恶性肿瘤严重危害人类健康，据统计2012年全世界约有1400万新增癌症病例，820万癌症死亡病例，其中，肺癌死亡病例为159万，占死亡病例的19.4％。2014年全国肿瘤登记中心发表的统计数据显示，所有新发恶性肿瘤中肺癌居首位，占恶性肿瘤新发病例的19.59%，死亡率占恶性肿瘤死因的24.87%。
　　（1,2-二氨基环己烷）二氯化铂(DACHPt)是一种顺铂的类似物，比顺铂毒性低且与顺铂无交叉耐药性。透明质酸(HA)是天然可降解的高分子材料，它是细胞间质的重要组成成分，可被淋巴系统所清除，透明质酸可以作为药物载体将药物递送到肿瘤组织中。聚乙二醇(PEG)亲水性强，是形成胶束应用较为广泛的亲水嵌段，可促进胶束对铂类药物的溶解。单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰的HA和 DACHPt所形成的靶向纳米胶束系统(mPEG-HA-Pt)由于增强渗透滞留效应(Enhanced Permeability and Retention Effect,EPR effect)而能够实现体内长循环，增加药物在肿瘤部位的高浓度聚集，降低对正常组织的毒副作用。本研究主要实验方法和结果：
　　1.mPEG-HA的合成
　　HA在pH7.4的PBS缓冲液中经EDC/NHS的催化作用下，室温活化2小时。按一定比例滴入mPEG-NH2，室温下继续反应24小时。反应产物经截留分子量(MW8kDa)的透析袋透析纯化48小时。冷冻干燥后制成mPEG-HA产物。
　　2.mPEG-HA的表征
　　通过傅里叶变换显微镜红外光谱(FT-IR)分析和核磁共振氢谱(1H NMR)分析进行mPEG-HA的结构表征。核磁共振图谱中(-OCH2CH2-:δ=3.72 ppm)为mPEG亚甲基的积分面积，(-COCH3:δ=2.02 ppm)为HA中甲基的积分面积，mPEG的取代度通过比较两者的积分面积获得。红外图谱显示，1736 cm?1处为OHC-PEG-CHO基团的C-O伸缩振动峰，1728 cm?1处为Gal-PEG-CHO基团的C-O伸缩振动峰,1060cm?1为C-N伸缩振动峰，说明HA成功接上了mPEG。
　　3.DACHPt靶向纳米胶束的制备
　　DACHPt在超声条件下混悬于去离子水中，然后加入一定量的AgNO3，避光反应24小时，形成DACHPt的混合溶液。然后将混合溶液在3000rpm转速下离心10分钟，去掉AgCl沉淀，最后产物用0.22μm的微孔滤膜过滤。取一定量不同取代度的mPEG-HA，加入DACHPt溶液中，所得混合溶液避光搅拌反应120小时。经超滤(MW100KDa)去除游离的DACHPt，最后制备得到DACHPt靶向纳米胶束。
　　4.DACHPt靶向纳米胶束的表征
　　制备得到的DACHPt靶向纳米胶束进行动态光散射和zeta电位分析。DACHPt靶向纳米胶束的粒径范围为70-100nm，平均粒径为86nm，随着PEG的取代度从0%到5%，靶向纳米胶束粒径逐渐降低。
　　5.透射电子显微镜观察DACHPt靶向纳米胶束的形态
　　通过透射电子显微镜观察的DACHPt靶向纳米胶束的形态呈球形，且大小分布均匀（＜100nm），可以说明mPEG-HA合成产物和DACHPt形成了具有核壳结构的靶向纳米胶束。
　　6.ICP-MS法测定DACHPt靶向纳米胶束的包封率和载药量
　　DACHPt靶向纳米胶束中铂的含量通过离子电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS法,Agilent7700s,USA)测得。DACHPt靶向纳米胶束的载药量和包封率分别为（19±0.24）%和（86±1.6）%。
　　7.体外药物释放实验
　　DACHPt靶向纳米胶束溶液密封放入透析袋中(MW8000KDa)测定体外药物释放量。实验结果表明，DACHPt显示出从纳米粒中持续释放的行为，并且DACHPt的释放过程分为两个阶段，前4小时的突然释放，随后24小时的持续缓慢释放。随着PEG取代度的增加，DACHPt的释放速率略微降低。
　　8.DACHPt靶向纳米胶束的体外细胞毒性实验
　　A549细胞以83103cells/well加入96孔板，分别加入培养液（阴性对照）、系列浓度的mPEG-HA溶液、DACHPt溶液（阳性对照组，用PBS溶解）、系列浓度的DACHPt靶向纳米胶束溶液做MTT测定试验。不同取代度的mPEG-HA对A549细胞的增长抑制作用没有显著性差异。不同取代度的DACHPt靶向纳米胶束对A549细胞的增长抑制作用没有显著性差异。不同浓度的DACHPt靶向纳米胶束对A549细胞的生长有显著性差异。各浓度组药物分别作用48小时后，对细胞生长抑制作用结果表明，细胞存活率与药物浓度呈反比，有明显的剂量依赖性，DACHPt靶向纳米胶束（取代度为2%）48小时时的细胞生长抑制作用较为明显。在剂量为1～100μg/mL范围内，DACHPt阳性对照组和DACHPt靶向纳米胶束组与空白对照组和 mPEG-HA空白胶束组相比，细胞增长抑制作用有显著性差异；剂量为0.01～100μg/mL范围内，DACHPt阳性对照组与DACHPt靶向纳米胶束组相比，细胞增长抑制作用没有显著性差异。
　　9.肺原位移植瘤模型建立
　　裸鼠左肺注入A549LUC细胞，建立肺原位移植瘤模型。
　　10.活体生物发光法评价A549LUC原位移植瘤模型的建立
　　腹腔注射荧光素酶底物，检测小鼠肿瘤生物发光情况。正常裸鼠检测生物发光结果无荧光信号；A549LUC细胞原位接种后肺部生物发光检测结果显示左肺有强荧光信号，而且转移至头部及右下肢，LUC基因表达正常，证明成功建立了A549LUC原位移植瘤模型。
　　11.裸鼠肺组织切片HE染色
　　将裸鼠处死后，取肺脏，以包音氏固定液固定24小时，之后送检HE染色切片，光镜下观察肿瘤组织病理形态及结构变化。正常肺泡间可见恶性细胞集团，呈腺腔样排列，部分腺体相互融合呈筛状，细胞可见异型性，核分裂明显，和增大可见核仁，核浆比增大，间质见少量炎症细胞浸润及见少量血管。
　　12.DACHPt靶向纳米胶束对裸鼠皮下移植瘤生长的影响
　　BALB/c裸鼠15只，雄性，体重16-18g左右时皮下给药，当肿瘤体积到达120mm3时，将动物随机分为三组，每隔一天静脉注射给药一次，保证给药剂量为4 mg单位DACHPt/kg小鼠体重，共给药4次。裸鼠体重阳性对照组与DACHPt靶向纳米胶束组间比较差异无统计学意义，但模型组与阳性对照组、DACHPt靶向纳米胶束组相比，具有显著性差异。肿瘤体积阳性组和DACHPt靶向纳米胶束组的肿瘤体积虽上升，但与模型组的肿瘤体积上升趋势相比，其上升幅度明显减少，均有显著性差异。
　　研究结论：
　　1.本实验所制备的基于PEG化HA的DACHPt靶向纳米胶束经红外光谱及核磁共振谱分析，确定了其结构。透射电镜下胶束形态呈球形，且分布均匀，体外药物释放实验显示其长效的药代动力学特点。
　　2.DACHPt靶向纳米胶束显著改善了 DACHPt的难溶性问题，胶束粒径小于100nm，可直接静脉给药。
　　3.MTT体外细胞增长抑制试验显示，DACHPt靶向纳米胶束具有明显抑制人非小细胞肺癌A549细胞的增殖作用。
　　4.通过活体生物发光法证实成功建立了A549LUC原位移植瘤模型。
　　5.体内抑瘤实验结果表示，DACHPt靶向纳米胶束对人非小细胞肺癌 A549细胞移植瘤具有明显的体内抑瘤作用及低的毒副作用。

目录

声明

英文缩略语表

技 术 路 线

前言

第一章 基于PEG化透明质酸的DACHPt靶向纳米胶束的构建与表征

1.1 材料与方法

1.2 实验结果

1.3 讨论

第二章 DACHPt靶向纳米胶束对A549非小细胞肺癌细胞的增殖抑制实验

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3讨论

第三章 裸鼠A549LUC细胞肺原位移植瘤模型的建立

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

第四章 DACHPt靶向纳米胶束抑制裸鼠肺癌模型的研究

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

第五章 全文总结与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

参考文献

致谢

文献综述一:EGFR和VEGF在肺癌中的表达及靶向治疗肺癌中的研究现状

文献综述二:抗肿瘤靶向药物研究现状

附录A：攻读学位期间发表的论文