维甲酸对碱烧伤引起的角膜新血管生成的作用及机制研究

摘要

研究背景：在正常生理条件下角膜是一种透明组织，但是在感染，异常免疫反应，化学烧伤或热烧伤等引起的炎症反应条件下会导致角膜病理性新生血管（CNV)生长。CNV是指血管从角膜缘向透明区长入的病理现象，如不及时治疗可危及视力，甚至致盲。在伤口愈合的过程中，CNV的程度是由促血管生成因子和抑制因子之间的平衡所决定的。因为CNV的发病机制非常复杂，所以目前对其治疗方法也不尽人意。如激素，激光，手术等治疗方法都被证实为变异性高，且在临床上受到很大程度的限制。因此，能否找到成本低，且副作用小的治疗方法，对治疗CNV具有很大的临床价值。维甲酸（RA）是一种能够调节细胞生长，分化及细胞外基质形成的维生素A衍生物。目前RA主要应用于牛皮癣和痤疮等疾病的治疗。研究表明，RA可以通过破坏整合素抑制RPE细胞增殖，并在体内抑制炎症反应和组织损伤，改善自身免疫性疾病动物模型的炎症，且具有较少的细胞毒性作用。众所周知，碱烧伤引起的角膜CNV可引起严重的炎症反应，甚至发生角膜溶解。因此人们经常会把碱烧伤动物作成新生血管模型。由于维甲酸具有抗炎症反应作用，本文将探讨维甲酸对碱烧伤诱导的实验性角膜新生血管的影响，并用人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）来进一步探讨其在体外的作用机制。
　　目的：观察RA在碱烧伤引起的角膜新生血管形成的影响。检测RA对碱烧伤角膜中VEGF和TSP-1的表达的影响，以及用人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）来进一步探讨其在体外的作用机制。对临床治疗角膜新生血管提供新的治疗方案提供理论依据。
　　材料和方法：本实验利用SD大鼠角膜做成碱烧伤模型。共120只大鼠随机分为4组（n=30）。第1组：对照组，无碱烧伤；第2组：PBS治疗碱烧伤；第3组：用维甲酸治疗碱烧伤；第4组：用维甲酸和抑制TSP-1活性多肽（TBP）联合治疗碱烧伤。四组大鼠都按同样的实验方法进行。即碱烧伤后第2，5，10天在立体显微镜下随机测量CNV面积。利用免疫印迹法测定角膜血管内皮生长因子（VEGF）和血小板反应蛋白-1（TSP-1）蛋白水平。在体外测定维甲酸对HDMEC细胞增殖，迁移和分化作用。采用ELISA法测定培养液中细胞分泌的TSP-1的水平。利用基因定量法测定HDMEC的TSP-1基因表达水平，并通过免疫印迹法证实其蛋白水平。
　　结果：角膜碱烧伤可引起TSP-1的表达水平下降，VEGF表达增加。Western印迹法测定发现在RA治疗组角膜TSP-1蛋白水平比PBS治疗组高（P＜0.05），而VEGF蛋白水平降低，并且RA治疗组TSP-1和VEGF表达水平随时间的递增而递减。RA治疗组相对于对照组在碱烧伤10天后表现为新血管生成减少。然而，同时利用血小板反应蛋白-1活性阻断多肽和RA治疗组比RA治疗组发生更多新血管生成。RA增加TSP-1的表达，但对细胞分泌TSP-1无作用。此外，RA抑制增殖的细胞和诱导细胞凋亡的细胞，且抑制细胞管的形成，但TBP会减弱RA的疗效。RA对细胞迁移没有影响。
　　结论：RA可减少碱烧伤引起的角膜新生血管形成。RA通过生产大量TSP-1和减少VEGF表达来保护化学性角膜损伤。RA可通过增加TSP-1表达水平途径降低细胞的增殖和分化，诱导细胞凋亡，从而减少新血管生成。

目录

声明

Abbreviations缩略语

1. INTRODUCTION

2.1 Materials

2.1.1 Cell culture

2.1.2 Animals

2.1.3Antiboies

2.2 Methods

2.2.1 Alkali-burn Corneal Injury and retinoic acid Treatment

2.2.2 Clinical Assessment of Corneal NV

2.2.3 Western blot analysis and ELISA

2.2.4Quantitative real-time PCR for TSP-1

2.2.5 Proliferation assay

2.2.6 Migration assay

2.2.7 Tube formation assay

2.2.8 Flow cytometry

2.2.10 Statistical analysis

3. RESULTS

3.1 Inhibitory effect of RA on corneal NV

3.2 Effect of RA on expression of angiogenic and anti-angiogenic factors

3.2.1 Effect of RA on expression of anti-angiogenic factor TSP-1 in alkali-burn induced CNV in vivo.

3.2.2 Effect of RA on expression of angiogenic factor VEGF in alkali-burn induced CNV in vivo.

3.3 Effect of RA on proliferation, migration and differentiation (tube formation) of microvascular endothelial cells in vitro

3.3.1 Effect of RA on proliferationof HDMEC in vitro

3.3.2 Effect of RA on migration of HDMEC in vitro

3.3.3 Effect of RA on differentiation of HDMEC in vitro

3.4 Effects of RA on the expression of TSP-1 in HDMEC

3.5 Effects of RA on the secretion of TSP-1 from HDMEC

3.6 Effects of RA on HDMEC apoptosis

3.7 Regulation of caspase-3 and Bcl-2 expression by RA

4. DISCUSSION

5. CONCLUSIONS

参考文献

综述:维甲酸对角膜碱烧伤的作用机制研究进展

致谢