乙醇对小鼠小脑浦肯野细胞活动及感觉信息突触传递的影响机制

摘要

本文主要从以下几个部分进行论述：
　　第一部分 乙醇对小脑皮层浦肯野细胞自发性复杂锋电位活动的影响
　　目的：
　　在离体条件下，小脑浦肯野细胞对乙醇敏感，可表现为简单锋电位(SS)放电频率的改变。然而，乙醇对活体动物小脑浦肯野细胞自发性复杂锋电位(CS)的影响机制还不清楚。因此，本研究拟应用在体膜片钳记录结合药理学手段研究乙醇对乌拉坦麻醉小鼠小脑浦肯野细胞自发性CS的影响机制。
　　方法：
　　成年ICR小鼠（6-8周龄）通过腹腔注射乌拉坦麻醉后，行气管插管后将动物固定在自制的脑立体定位仪上，在小脑VermisⅥ-Ⅶ区相对应处行开颅手术，钻一个直径约为1-1.5mm小孔，暴露记录部位的小脑表面，用蠕动泵在脑表面持续灌流含氧的人工脑脊液(ACSF)。浦肯野细胞贴附式和在体全细胞膜片钳记录使用Axopatch-200B放大器.浦肯野细胞自发性活动的全细胞记录数据通过D/A转换器1440、Clampex10.3软件和计算机获取。记录电极内填充电极内液，填充后阻抗为4-6MΩ。在软脑膜下方150-200微米处实施浦肯野细胞全细胞记录，浦肯野细胞的认定是通过其规律的SS放电伴随有不规律CS放电特征来判断的，并通过生物素染色来确定。电生理学数据分析采用Clampfit10.3软件，所有数据采用均数±标准误表示，并应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05被认为实验组之间有显著性差异。
　　结果：
　　(1)电流钳记录模式下，脑表面灌流乙醇(300 mM)对浦肯野细胞自发性CS频率没有显著影响，明显降低自发性CS引起的SS放电暂停时间并降低CS的AHP振幅。
　　(2)电压钳记录模式下，乙醇(300 mM)的使用显著抑制浦肯野细胞自发性CS波型，表现为波形下面积(AUC)的减少和放电小穗数量的减少，但不改变CS自发性活动频率及其小穗即时频率。
　　(3)乙醇导致的浦肯野细胞自发性CS波形AUC的减少具有剂量依存性，半数抑制剂量为168.5 mM。
　　(4)阻断NMDA和mGluR1受体降低自发性CS小穗数量和AUC，但不能阻断乙醇对CS的抑制作用。
　　(5) CB1受体阻断剂，AM251可以阻止乙醇对CS诱发SS放电暂停、AHP振幅、小穗数量和AUC的抑制作用。此外，应用CB1受体激动剂，WIN55212-2可显著抑制CS的小穗数量、AUC、CS诱发SS放电暂停和AHP振幅。
　　结论：
　　(1)本研究表明乙醇通过活化CB1受体导致小鼠小脑浦肯野细胞自发性CS活动抑制，提示过量饮酒可能通过活化CB1受体抑制外周感觉信息向小脑皮层浦肯野细胞的传递。
　　(2)乙醇对自发性CS活动的影响可能在一定程度上反映急性酒精中毒对小脑皮层感觉信息传递的损伤。
　　第二部分 乙醇对面部感觉刺激诱发小鼠小脑皮层浦肯野细胞外向电流的影响机制
　　目的：
　　急性过量摄入乙醇可引起小脑运动调节功能障碍甚至共济失调。我们最近研究发现乙醇降低感觉刺激诱发小鼠小脑皮层分子层GABA能抑制性反应，提示乙醇调节面部感觉刺激在小鼠小脑浦肯野细胞上诱发的反应。因此，本研究拟应用在体膜片钳记录结合药理学手段研究乙醇对乌拉坦麻醉小鼠小脑浦肯野细胞感觉刺激诱发外向电流的影响机制。
　　方法：
　　成年ICR小鼠（6-8周龄）通过腹腔注射乌拉坦麻醉后，行气管插管后将动物固定在自制的脑立体定位仪上，在小脑VermisⅥ-Ⅶ区相对应处行开颅手术，钻一个直径约为1-1.5mm小孔，暴露记录部位的小脑表面，用蠕动泵在脑表面持续灌流含氧的人工脑脊液(ACSF)。浦肯野细胞贴附式和在体全细胞膜片钳记录使用Axopatch-200B放大器.浦肯野细胞自发性活动的全细胞记录数据通过D/A转换器1440、Clampex10.3软件和计算机获取。记录电极内填充电极内液，填充后阻抗为4-6MΩ。在软脑膜下方150-200微米处实施浦肯野细胞全细胞记录，浦肯野细胞的认定是通过其规律的SS放电伴随有不规律CS放电特征来判断的，并通过生物素染色来确定。应用压力喷射系统向同侧触须垫吹风(30 ms，60 psi)进行面部感觉刺激，吹风刺激由电脑控制并通过Master8和Clamfit10.3软件与电信号记录同步。电生理学数据分析采用Clampfit10.3软件，所有数据采用均数±标准误表示，并应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05被认为实验组之间有显著性差异。
　　结果：
　　(1)在电流钳记录模式下，吹风刺激小鼠触须垫可诱发小脑PC产生抑制性突触后电位(IPSP)，并伴有自发性SS放电暂停。脑表面灌流乙醇(300 mM)明显抑制IPSP和自发性放电暂停时间。
　　(2)电压钳记录模式下，乙醇(300 mM)抑制感觉刺激诱发浦肯野细胞外向电流，导致外向电流振幅降低，半宽值减小，上升时间和延迟时间缩短。
　　(3)乙醇对感觉刺激诱发小脑皮层浦肯野细胞外向电流的抑制作用具有剂量依存性，半数抑制剂量为148.5 mM。
　　(4)应用CB1受体阻断剂，AM251和0-2050可以阻断乙醇对感觉刺激诱发小脑皮层浦肯野细胞外向电流的抑制作用。应用CB1受体激动剂也可以阻断乙醇对感觉刺激诱发小脑皮层浦肯野细胞产生外向电流的抑制作用。
　　结论：
　　(1)乙醇通过活化突触前CB1受体抑制感觉刺激诱发小脑皮层浦肯野细胞外向电流。
　　(2)过量摄入乙醇对小脑皮层感觉信息的处理的损害作用有一部分是通过抑制分子层中间神经元向浦肯野细胞释放GABA引起的，这为乙醇损害小脑功能提供了一个新机制。

目录

声明

CONTENTS

LIST OF ABBREVIATION

Chapter 1 Effect of ethanol on spontaneous complex spike activity of cerebellar Purkinje cell in vivo in mice

Abstract

摘要

1．1 Introduction

1．2 Materials and Methods

1．2．1 Anesthesia and surgical procedures

1．2．2 Electrophysiological recording and drug application

1．2．3 Histochemistry

1．2．4 Chemicals

1．2．5 Data analysis

1．3 Results

1．3．1 Ethanol inhibited the waveform of spontaneous complex spikes(CS)of cerebellar PCs

1．3．2 Blockade of mGluR1 and NMDA receptors failed to prevented the ethanol-induced inhibition of CS activity

1．3．3 Ethanol-induced depression of CS waveform was abolished by blocking CB1 receptors activity

1．4 Discussion

1．4．1 Ethanol modulates the spontaneous CS firing of cerebellar PCs

1．4．2 Activation of CB1 receptors induces an inhibition in synaptic transmitter release at CF-PC synapses

1．4．3 Ethanol modulates the spontaneous CS firing of cerebellar PCs via activation of CB1 receptors activity

References

Chapter 2 Mechanism of ethanol modulation of the facial stimulation-evoked outward currents of cerebeilar Purkinje cell in into mice

Abstract

摘要

2．1 Introduction

2．2 Materials and Methods

2．2．1 Anesthesia and surgical procedures

2．2．2 Electrophysiological recording and facial stimulation

2．2．3 Chemicals

2．2．4 Data analysis

2．3 Results

2．3．1 Ethanol inhibited the facial stimulation-evoked outward currents in cerebeHar PCs

2．3．2 Ethanol-induced inhibition of facial stimulation-evoked inward currents was involved in activation of CB1 receptor

2．4 Discussion

2．4．1 Facial stimulation excites MLIs and evokes outward currents in cerebellar PCs

2．4．2 Ethanol inhibits facial stimulation evoked MLI-PC GABAergic synaptic transmission in cerebellar PCs

2．4．3 Ethanol inhibits facial stimulation evoked outward currents in cerebellar PCs via activation of eCB system

References

Review Effects of ethanol on neurotransmitter system in central nervous system

Publications

致谢