鹿源布鲁氏菌外膜蛋白Omp31基因的克隆与原核表达

摘要

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人畜共患传染病，主要宿主是羊、牛和猪，呈世界范围流行，并且鹿场感染布鲁氏菌的现象逐渐增多。近几年来，布鲁氏菌病在中国的流行呈上升趋势，严重危害了畜牧业发展和人类健康。目前，对易感动物进行疫苗免疫和对患病动物进行扑杀是防控布鲁氏菌病的有效手段。所以，利用生物学手段研制出高效、安全的疫苗，并迅速对布鲁氏菌病进行准确诊断是预防布鲁氏菌病的关键。
　　在布鲁氏菌众多具有抗原保护作用的外膜蛋白中，Omp31作为布鲁氏菌的免疫保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，是基因工程疫苗的理想候选基因，也是用于布鲁氏菌临床诊断的首选基因和蛋白。此外，外膜蛋白Omp31是布鲁氏菌的毒力基因，高度保守，Omp31基因的缺失可降低布鲁氏菌的毒力，所以可以通过缺失Omp31基因来研制基因缺失疫苗。本研究从疑似感染布鲁氏菌的鹿病料中提取基因组DNA，经PCR扩增和TA克隆，构建克隆载体pMD18T-Omp31，经转化和提取质粒，以及BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，将获得的Omp31基因亚克隆至pET28a原核表达载体，构建pET28a-Omp31原核表达载体，将其转化入大肠杆菌BL21感受态，经IPTG诱导，使Omp31基因在大肠杆菌BL21感受态中表达，并经Western Blot确定该重组蛋白的反应原性。结果显示，本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Omp31，经IPTG诱导，其可在大肠杆菌BL21感受态中获得稳定表达，Omp31重组蛋白以包涵体形式存在，镍柱纯化的蛋白浓度较高，Western Blot试验显示其具有良好的反应原性。
　　本研究成功表达和纯化的Omp31重组蛋白不仅浓度较高，也具有较好的反应原性，为进一步研制布鲁氏菌的亚单位疫苗、基因缺失疫苗和ELISA诊断试剂盒奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 布鲁氏菌病国内外的流行状况

1．1．1 世界范围内的布鲁氏菌病疫情

1．1．2 国内布鲁氏菌病的疫情

1．2 布鲁氏菌病的病原学

1．3 布鲁氏菌的感染过程及症状

1．4 布鲁氏菌病疫苗的研究进展

1．5 布鲁氏菌病的诊断方法

1．6 布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的研究进展

1．7 研究的目的和意义

2 布鲁氏菌Omp31基因的扩增及载体构建

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 溶液配制

2．2 实验操作步骤

2．2．1 pMD18-T-Omp31克隆载体的构建

2．2．2 pET28a-Omp31表达载体的构建

2．3 结果

2．3．1 PCR扩增结果

2．3．2 pMD18T-Omp31克隆载体的构建

2．3．3 pMD18T-Omp31克隆载体双酶切结果

2．3．4 pET28a-Omp31克隆载体构建结果

3 布鲁氏菌Omp31蛋白原核表达及纯化

3．1 材料和方法

3．1．1 主要试剂

3．1．2 仪器

3．1．3 溶液配置

3．2 实验操作步骤

3．2．1 蛋白诱导

3．2．2 蛋白纯化

3．3 结果分析

3．3．1 小量诱导结果

3．3．2 超声破碎及纯化结果

4 Omp31蛋白的Western Blot鉴定

4．1 材料和方法

4．1．1 材料

4．1．2 试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 溶液配置

4．2．1 主要方法步骤

4．3 结果分析

4．3．1 BCA法蛋白浓度测定结果

4．3．2 Western Blot结果

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢

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