猪肺泡巨噬细胞M1亚型及猪KLF4基因对PRRSV复制影响的初步研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是最早于1987年在美国首次被发现的一种新型病毒性传染病，是现今世界上危害养猪业最重要的疾病之一。巨噬细胞是一种分布广泛的免疫细胞，可以根据内环境的变化从而极化为不同的类型:经典活化巨噬细胞(M1)，以及替代活化巨噬细胞(M2)。猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage，PAMs)是PRRSV感染后猪只体内最重要的靶细胞。所以本实验首先通过建立PAMs体外极化模型，研究PAMs极化对PRRSV感染的影响以及PRRSV感染对PAMs影响的动态学变化。实验采用预冷法分离PAMs，并在体外进行培养，分别用LPS/IFN-γ诱导刺激M1型巨噬细胞;用IL-4诱导刺激分化为M2型巨噬细胞。通过半定量PCR分别检测M1，M2型Marker（M1:IL-1β，IL-12，IL-23和CXCL10; M2:Arg-1，IL-10，PPARγ和YM-1）表达量的变化，从核酸水平上证明极化模型的成功。同时用Western blotting从蛋白水平上确定M1型，M2型PAMs的极化成功。之后用500TCID50 HuN4-F5株PRRSV感染极化后的PAMs亚型，在感染后的12，24，36和48h分别通过间IFA和Western blotting对PRRSV的感染量进行测定。结果发现在感染后的12至36h内M1型PAMs中PRRSV的感染量明显低于正常组和M2型PAMs的感染量，而在感染后的48h时M1组中PRRSV的感染量与正常组和M2型PAMs中的感染量基本一致，无显著性的差异。
　　然而PAMs主要通过其表面的模式识别受体(pattern recognitionreceptor, PRR)发挥其天然免疫防御的功能。那么是否PRRSV感染M1型巨噬细胞对其模式识别受体产生了影响，从而M1型巨噬细胞对PRRSV感染在一段时间内产生了抑制。因此我们通过荧光定量PCR的方法对感染PRRSV的M1型巨噬细胞模式识别受体mRNA的表达量进行了测定，并同时对被认为是巨噬细胞极化的关键调节因子的KLF4基因也进行了测定。而在测定结果中我们意外的发现PRRSV感染极化后M1型巨噬细胞中的KLF4表达量与M1型巨噬细胞对PRRSV复制的影响趋势相似。结果表明感染PRRSV后，随着时间的变化M1型巨噬细胞中KLF4的表达量逐渐降低，在12h达到最低，24h后KLF4的表达量逐渐升高，且在感染后48h时KLF4的表达量与正常组的表达量基本一致，无显著性差异。
　　因此为了进一步研究猪KLF4基因对PRRSV复制的影响，本实验通过PCR技术扩增得到猪KLF4基因，通过TA克隆构建pMD18-T-KLF4重组质粒。酶切鉴定后将KLF4的cDNA亚克隆至pCMV-HA载体，构建重组质粒pCMV-HA-KLF4。转染重组质粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145中，12h后感染PRRSV,并在感染后24h通过Western blotting对PRRSV的感染量进行进行测定。结果表明KLF4基因对PRRSV的感染有一定的促进作用。

目录

声明

摘要

前言

1 猪繁殖与呼吸综合征概述

1．1 猪繁殖与呼吸综合征概述

1．2 猪繁殖与呼吸综合征病毒

2 巨噬细胞概述

2．1 天然免疫

2．2 巨噬细胞

2．3 单核-巨噬细胞系统

2．4 巨噬细胞极化

2．5 巨噬细胞极化与疾病的相关性

3 KLF4及其与病毒感染

4 研究目的和意义

材料与方法

1 材料

1．1 试验动物

1．2 试验细胞

1．3 试验病毒

1．4 试验主要试剂

2 方法

2．1 PAMs的分离培养

2．2 间接免疫荧光鉴定PAMs的纯度

2．3 PAMs体外极化刺激处理

2．4 半定量PCR测定极化相关因子mRNA表达水

2．5 Western blot检测极化标记分子蛋白表达水平

2．6 iNOS活性的测定

2．7 Arg-1活性的测定

2．8 PRRSV TCID50的测定

2．9 PRRSV感染PAMs极化亚型细胞

2．10 荧光定量PCR

2．11 猪KLF4基因的PCR扩增

2．12 PCR产物的纯化回收

2．13 目的基因KLF4与pMD-18T simple载体重组连接

2．14 重组连接后质粒的转化

2．15 重组克隆的筛选

2．16 摇菌

2．17 提取重组克隆质粒

2．18 pCMV-HA真核表达质粒的构建

2．19 转染重组质粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145细胞中的表达及其对PRRSV复制影响的初步探索

2．20 数据统计及分析

结果

1 猪肺泡巨噬细胞(PAMs)纯度的鉴定

2 猪肺泡巨噬细胞(PAMs)体外极化模型的建立

2．1 半定量PCR鉴定巨噬细胞的极化状态

2．2 iNOS和Arginase-1酶活性的测定

2．3 IL-12和Arg-1蛋白含量的检测

3 PAMs极化的亚型对PPRSV增殖的影响

3．1 PRRSV N蛋白间接免疫荧光的观察

3．2 N蛋白的定量分析

4 PRRSV感染M1型巨噬细胞对其模式识别受体mRNA表达的影响

4．1 感染PRRSV后M1型巨噬细胞模式识别受体mRNA表达

4．2 感染PRRSV后M1型巨噬细胞KLF4表达

5．猪KLF4基因真核表达载体构建

5．1 PCR扩增结果

5．2 重组质粒pMD-18T-KLF4质粒的筛选及鉴定

5．3 重组质粒pMD-18T-KLF4的测序分析

5．4 重组质粒pCMV-HA-KLF4的酶切鉴定

6 转染重组质粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145细胞中的表达及其对PRRSV复制影响的初步探索

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

在研期间发表论文情况