二氢槲皮素基于NLRP3炎症小体通路调控酒精性脂肪肝与炎症的机制研究

摘要

目的:
　　二氢槲皮素是一种黄酮类化合物，据前期研究发现二氢槲皮素有很强的抗氧化作用，具有很高的潜力。本研究通过狂饮酒精性脂肪肝模型和急性酒精性脂肪肝模型，探讨二氢槲皮素是否对酒精性脂肪肝小鼠有抑制脂肪蓄积的作用。
　　方法:
　　1.狂饮酒精性脂肪肝小鼠模型的体内实验:给药低中高剂量组每天给予不同浓度的二氢槲皮素(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg)共5天，给药第5天时给药4小时候每隔30分钟给予33％酒精共3次。用试剂盒检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)水平和肝组织中的甘油三酯(TG)的水平，通过HE染色和免疫组织化学染色方法观察二氢槲皮素对小鼠肝脏组织形态学变化的影响。
　　2.急性酒精性脂肪肝小鼠模型的体内实验:酒精组隔12小时给予33％酒精（5g/kg）共3次，给药低中高剂量组每隔12小时同时给予二氢槲皮素(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg)和酒精共3次。用试剂盒检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)水平和肝组织中的甘油三酯(TG)的水平，通过HE染色和免疫组织化学染色方法观察二氢槲皮素对小鼠肝脏组织形态学变化的影响;通过蛋白印迹观察小鼠肝脏LKB1、乙酰辅酶a羧化酶(Acetyl CoACarboxylase，ACC)、AMP依赖的蛋白激酶α(AMP-activated Kinaseα，AMPKα)等脂肪合成与氧化相关因子及炎症小体相关因子表达变化。
　　3.急性酒精性脂肪肝体外实验:HepG2细胞给予不同浓度的二氢槲皮素，间隔1小时后给予大剂量酒精诱导肝细胞损伤，24小时后刮蛋白做蛋白印迹实验，检测AMPKα、ACC、IL-1β的表达;HepG2细胞敲除P2x7R，间隔30小时后给予二氢槲皮素和酒精，24小时后通过荧光染色观察SREBP-1的表达;LPS+ATP刺激肝癌细胞株HepG2，并通过Western Blot检测、HepG2胞内P2x7R和pro-IL-1β活化片段。
　　结果:
　　1.狂饮酒精性脂肪肝小鼠模型中，二氢槲皮素组能够明显降低小鼠血清及肝脏组织中TG的含量，减少血清中ALT、AST的含量;HE染色和免疫组化结果表明二氢槲皮素能明显减轻酒精引起的肝脏脂肪变性。
　　2.急性酒精性脂肪肝小鼠模型中，二氢槲皮素组能够明显降低小鼠血清及肝脏组织中TG的含量，减少血清中ALT、AST的含量;HE染色和免疫组化结果表明二氢槲皮素能明显减轻酒精引起的肝脏脂肪变性;二氢槲皮素明显减少了P2x7R、Caspase-1及NLRP3炎症小体的阳性表达，减少了巨噬细胞及中性粒细胞的炎性募集。同时二氢槲皮素能够活化AMPKα、SIRT-1，抑制ACC和SREBP-1的表达。
　　3.体外实验中二氢槲皮素明显抑制了酒精诱导的肝细胞中ACC、IL-1β的表达，同时激活了AMPKα、LKB1。
　　结论:
　　本实验证明二氢槲皮素对狂饮酒精性脂肪肝小鼠和急性酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂肪积蓄有一定的保护作用，同时对脂肪肝伴有的炎症也有一定的抑制作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词表(Abbreviation)

第一章 引言

1．1．1 主要实验仪器

1．1．2 主要试剂

1．2 实验动物

1．3 狂饮酒精肝损伤小鼠模型的建立

1．4 急性酒精肝损伤小鼠模型的建立

1．5 急性酒精性脂肪肝体外实验

1．6 实验方法

1．6．1 生化指标的测定与实验方法

1．6．2 蛋白印迹实验

1．6．3 免疫组化实验

1．6．4 石蜡切片HE染色实验

1．6．5 免疫荧光实验

1．6．6 冷冻切片油红O染色实验

1．6．7 统计分析

第二章 狂饮酒精性脂肪肝小鼠模型实验结果

2．1 生化指标检测结果

2．2 二氢槲皮素对狂饮酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织形态学的影响

第三章 小鼠急性酒精性脂肪肝模型实验结果

3．1 二氢槲皮素对小鼠急性酒精性脂肪肝模型生化指标的检测

3．2 二氢槲皮素对急性酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织形态学的影响

3．3 二氢槲皮素对小鼠急性酒精性脂肪肝的炎症小体激活的影响

3．4 二氢槲皮素对酒精刺激的HepG2细胞中脂肪蓄积及炎症因子表达水平的影响

3．5 二氢槲皮素P2x7R依赖性调控酒精刺激HepG2细胞中脂肪蓄积的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

附录