乙醇对延边地区朝鲜族、汉族冠心病患者血浆eNOS/NO水平的影响及其机制

摘要

目的:
　　探讨延边地区朝鲜族、汉族人群之间冠心病的危险因素、病变程度，以及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)在患者血浆中水平差异的分子机制。
　　方法:
　　(1)将入选患者按民族分为朝鲜族及汉族两组，统计各组患者的临床资料，包括年龄、体质指数(BMI)、既往史、吸烟史、乙醇摄入量等，以及冠状动脉造影结果;酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆NO、eNOS、神经型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平。(2)根据患者乙醇摄入差异和血浆eNOS/NO水平的差异，进行细胞实验，探讨乙醇对eNOS/NO水平的影响及机制。分离并培养人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)，蛋白免疫印迹(WesternBlotting)明确乙醇降低HUVECs eNOS蛋白表达的浓度及时间关系;在该浓度时间条件下观察细胞形态，并进行MTS实验检测细胞增殖，以及细胞流式检测细胞凋亡;将后续实验分为对照组(Control)、乙醇组（浓度设定为200mM）、Tiron（活性氧清除剂）组、Tiron+乙醇组、GKT137831（NOX1/NOX4抑制剂）组、GKT137831+乙醇组、SC-79（Akt激活剂）组、SC79+乙醇组，通过Western Blotting检测Akt、eNOS蛋白的表达以及磷酸化蛋白p-eNOS Ser1177水平，探究乙醇降低eNOS表达的机制;Griess法测定各组细胞加入eNOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)前后NO的浓度。
　　结果:
　　(1)两组患者间的一般资料比较，结果显示，在慢性饮酒量上，朝鲜族患者明显高于汉族患者(p＜0.05);两组患者冠状动脉造影结果显示，朝鲜族患者多支病变所占比例明显高于汉族患者(p＜0.05);血浆一氧化氮合酶(NOS)和NO浓度检测结果显示，朝鲜族患者血浆eNOS浓度显著低于汉族患者(p＜0.05)，NO浓度显著低于汉族患者(p＜0.05)，而血浆iNOS、nNOS浓度均无显著差异(p＞0.05)。(2)细胞实验中，与对照组相比，1h、6h条件下，各处理浓度乙醇对HUVECs的eNOS蛋白表达无显著差异(p＞0.05)，24h、200mM乙醇浓度培养条件下，HUVECs的eNOS蛋白表达显著降低(p＜0.01)，而48h、50mM、100mM和200mM乙醇浓度培养条件下，HUVECs的eNOS蛋白表达显著降低(p＜0.05，p＜0.01和p＜0.01);与对照组相比，200mM乙醇浓度培养24h下，细胞基本形态无明显改变，不影响HUVECs增殖(p＞0.05)，对细胞无明显毒性作用(p＞0.05);Tiron、GKT137831的预处理并未影响乙醇减少eNOS蛋白的表达的作用(p＜0.05);SC-79预处理细胞后抑制了乙醇减少eNOS总蛋白的表达(p＜0.01)以及磷酸化蛋白p-eNOS Ser1177水平(p＜0.01);未加入L-NAME情况下，与Control组相比，乙醇组NO生成明显减少(p＜0.01)，而SC-79组和SC-79+乙醇组的NO生成无明显差异(p＞0.05)，且均比乙醇组高。而在加入L-NAME情况下，Control组、SC-79组和SC-79+乙醇组均比未加入L-NAME时NO产量明显减少(p＜0.05、p＜0.01和p＜0.05);乙醇组NO产量与未加入L-NAME时无明显差异(p＞0.05)。
　　结论:
　　1.朝鲜族冠心病病变程度重于汉族患者，且可能与朝鲜族乙醇摄入量高密切相关;
　　2.乙醇通过下调Akt/eNOS途径，降低HUVECs的eNOS源性NO释放，可能为饮酒对冠心病产生有害影响提供新的理论依据。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 前言

第二章 实验方法

2．1 主要实验试剂、配制方案

2．2 临床数据收集及免疫学、生化指标的检查以及分组

2．3 ELISA

2．4 细胞培养

2．5 细胞实验分组

2．6 Western Blotting分析

2．7 MTS试验

2．8 细胞流式Annexin V／PI双标染色法检测细胞凋亡

2．9 NO浓度测定

2．10 统计学分析

第三章 结果

3．1 两组患者一般资料及各项指标的分析

3．2 两组患者血浆NO以及eNOS、nNOS和iNOS水平的分析

3．3 明确乙醇降低HUVECs中eNOS蛋白表达的浓度及时间关系

3．4 在观测条件下不影响细胞的基本形态，且不影响细胞活力，对细胞无明显毒性作用

3．5 乙醇不通过氧化应激途径影响细胞eNOS蛋白的表达

3．6 乙醇通过Akt／eNOS／NO通路减少eNOS、p—eNOSSerl177蛋白的表达以及eNOS源性NO的释放

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

综述