禽副黏病毒6型Hubei株分离鉴定与SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

APMV-6是单股负链病毒目(Mononegavirales)，副黏病毒科(Paramyxoviridae)，副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)成员。流行病学调查发现多种水禽体内可分离到APMV-6毒株，也可在试验中使用9-11日龄的鸡胚繁殖病毒。APMV-6可引起禽类出现轻微的呼吸道症状，也可导致其产蛋量下降。国内国外对于禽副黏病毒6型的研究较少，目前在GenBank中APMV-6毒株完整序列只有9条，所以通过本试验分析APMV-6的流行规律、生物学特性以及建立一种针对APMV-6的高效检测方法是很有必要的。
　　首先对中国5个地区的样本采集，对样本进行病毒培养后利用普通PCR进行检测，对阳性样品测序验证阳性样品为APMV-6后，对其进行基因组扩增并进行序列分析。然后对鉴定为APMV-6的样品进行传代，并对每代病毒进行红细胞凝集试验验证其血凝性。最后建立一种SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法并对方法进行优化，评价其敏感度、特异性、重复性等指标。
　　本试验采集11368份样本分离到1株APMV-6并命名为Hubei株。Hubei株基因组全长为16236bp，符合禽副黏病毒的六碱基原则，对Hubei株进行遗传进化分析，属于基因1型，1a亚型。对Hubei株进行血凝试验时，发现Hubei株在F1，F2两代没有发生血凝现象，然而在F3代发生了血凝现象，此现象并不符合禽副黏病毒具有血凝性的生物学特征。根据GenBank发表的APMV-6参考毒株（登录号:KF267717）M基因序列，利用Oligo7设计合成1对引物，以重组阳性质粒为标准品，建立了APMV-6 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法经优化后线性关系良好，标准曲线R2=0.998。本方法敏感度高，特异性强，重复性好，最低检出拷贝数为2.78×102 copies/μL，与NDV、APMV-4、APMV-13和GPV不发生特异性反应，比常规检测方法检出率高18％。
　　本试验成功分离到APMV-6 Hubei株，核苷酸序列全长为16236bp;并建立了针对禽副黏病毒6型的荧光定量PCR检测方法。

目录

声明

摘要

前言

1 禽腮腺炎病毒属概述

2 禽副黏病毒6型研究进展

3 实时荧光定量PCR研究进展

3．1 荧光染料法

3．2 荧光标记探针法

3．3 荧光标记引物

3．4 绝对定量和相对定量

4 研究目的与意义

材料与方法

1 材料

1．1 样本和试验动物

1．2 试验试剂

1．3 试验耗材与仪器

1．4 试验所需溶液配置

2 方法

2．1 Hubei株的分离与鉴定

2．2 Hubei株的血凝性初步研究

2．3 APMV-6荧光定量PCR荧光定量检测方法的建立与初步应用

结果

1 Hubei株的分离与鉴定

1．1 样本采集

1．2 病毒的分子生物学鉴定

1．3 APMV-6序列与进化树分析

2 Hubei株的血凝性初步研究

3 APMV-6荧光定量PCR荧光定量检测方法的建立与初步应用

3．2 实时荧光定量PCR反应体系条件优化结果

3．3 实时荧光定量PCR标准曲线分析

3．4 重复性试验

3．5 特异性试验

3．6 临床样品检测

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

附录