云南蚊宏病毒组学分析及新分离乙型脑炎病毒特性研究

摘要

目的:通过对中国云南省部分地区蚊宏病毒组学及新分离乙型脑炎病毒特性进行研究，分析云南省潜在的病毒种类及分布，以及新分离乙型脑炎病毒的变异及流行病学，为今后该地区病毒病的防控及向其他地区传播控制提供参考。 材料与方法:(1)宏基因组学:蚊样品现场采集;实验室鉴定蚊种类并分组;蚊样品研磨;研磨液上清过滤除菌;核酸酶降解宿主核酸;提取蚊样品RNA获得宏病毒组核酸;宏病毒组核酸反转录及SISPA扩增合成sscDNA宏病毒组核酸序列;采用Klenow片段合成dscDNA宏病毒组核酸序列;ExonⅠ及SAP去除寡聚核苷酸引物及游离核苷酸;dscDNA宏病毒组核酸序列SISPA扩增;dscDNA宏病毒组核酸序列纯化除去寡核苷酸;琼脂糖凝胶电泳鉴定SISPA扩增产物长度范围;NanoDrop检测dscDNA宏病毒组核酸序列纯化产物浓度;第二代高通量测序技术检测宏病毒组核酸序列;注释宏病毒组序列信息;特定病毒PCR/RT-PCR检测;扩增序列Neighbor-joining进化分析。(2)病毒特性研究:蚊样品现场采集;实验室鉴定蚊种类并分组;蚊样品研磨;Nested-PCR鉴定病毒种类;特定病毒蚊样品研磨液上清过滤除菌;无菌上清液接种BHK-21细胞传代培养;CPE，Nested-PCR，IFA，负染电镜鉴定细胞培养物特定病毒增殖;Neighbor-joining分析新分离乙型脑炎病毒变异及流行病学分析。 结果:Illumina测序揭示了中国云南地区蚊病毒组成;通过基因注释，超过50个病毒科被发现存在于云南蚊中，包括圆环病毒科、细环病毒科、细小病毒科和黄病毒科等多种病毒科;通过Illumina测序共获得22，964，305个序列读长，其平均长度为186个核苷酸，共获得序列重叠群为10，538，636个，重叠率占91.78％;分析Illumina测序结果并统计发现，三个样品病毒序列所占比例分别为3.84％、17.84％、0.17％;根据病毒宿主对病毒序列进行分类并统计发现，脊椎动物病毒占87.4％，植物病毒占5.4％，真菌病毒占1％，昆虫病毒和噬菌体分别占0.8％和0.6％;在此背景上，经BLAST比对搜索及巢式PCR方法鉴定出三段DENV病毒序列、两段ZIKV病毒序列及一段JEV病毒序列，DENV病毒序列分别为:一个1231个核苷酸长度的片段(DENV-China/YN2016-1)、一个491个核苷酸长度的片段(DENV-China/YN2016-2)，以及一个939个核苷酸长度的片段（DENV-China/YN2016-3），其分别编码部分非结构蛋白NS4A到NS5、部分囊膜蛋白E以及部分非结构蛋白NS5;系统进化分析显示DENV-China/YN2016-2属于基因Ⅳ型DENV病毒;ZIKV病毒序列分别为:一个694个核苷酸长度的片段(ZIKV-China/YN2016-1)和一个470个核苷酸长度的片段(ZIKV-China/YN2016-2)，其均编码部分非结构蛋白NS3;系统进化分析显示ZIKV-China/YN2016-1属于亚洲型ZIKV病毒;核苷酸同源性分析发现DENV-China/YN2016-2与1991年DENV泰国分离株亲缘关系最近，其同源性为95.3％，ZIKV-China/YN2016-1与2004年ZIKV泰国分离株亲缘关系最近，其同源性为97.1％;通过IFA和负染电镜实验对JEV病毒分离株JEV-China/YN2016-1进行了鉴定;经测定JEV-China/YN2016-1病毒滴度为6.30×105TCID50/0.1mL，经乳鼠接种，其半数致死量为3.16×103LD50/0.03mL;病理切片观察发现，乳鼠接种JEV-China/YN2016-1后，脑部出现了一系列病理变化，如液化性坏死、神经性坏死、环状出血、单核细胞增生以及胶质细胞结节增生。系统进化分析显示JEV-China/YN2016-1属于基因Ⅰ型JEV病毒;核苷酸同源性分析发现JEV-China/YN2016-1与2009年JEV老挝分离株亲缘关系最近，其同源性为98.8％;氨基酸变异分析发现在E蛋白340位缬氨酸或丝氨酸替换为丙氨酸。 结论:(1)Illumina测序揭示了中国云南地区蚊含有丰富的病毒种类;(2)基因Ⅳ型DENV病毒和基因Ⅰ型JEV病毒依然在云南地区流行，ZIKV病毒已经在该地区出现传播痕迹;（3)JEV病毒在云南地区的分离及变异，预示其可能形成新的流行态势。

目录

声明

摘要

ABSTRACT

CONTENTS

ABBREVIATIONS

Chapter Ⅰ

1．INTRODUCTION

2．MATERIALS AND METHODS

2．1 Materials

2．2 Methods

3．RESULTS

3．1 Illumina Sequencing and the Virome of Mosquitoes

3．2 Differential analysis of viral families in three samples

3．3 PCR Identification of Metavirome Results

3．4 PCR Amplification of Dengue Virus Gene

3．5 PCR Amplification of Zika Virus Gene

3．6 PCR Amplification of Japanese encephalitis virus Gene

4．DISCUSSION

5．CONCLUSIoNS

Chapter Ⅱ

1．INTRODUCTION

2．MATERIALS AND METHODS

2．1 Design of universal primers

2．2 Mosquitoes collection

2．3 Extraction of viral RNA

2．4 Detection of viruses

2．5 Phylogenetic analysis for the full E sequences of JEV

2．6 Cell culture

2．7 Isolation of viruses

2．8 Identification by indirect immunofluorescence assay(IFA)

2．9 Observation of negative-stain electron microscopy

2．10 Whole genome sequencing of newly isolated JEV

2．11 Detection of viral titer

2．12 Viral LD50 detection on suckling mice

2．13 Pathological changes in cerebrum of BALB／c suckling mice after inoculation with JEV

2．14 Detection of virai titer of different passages

2．15 The variability of envelope(E)gene of different passage viruses

2．16 The variability of envelope gene of different passage viruses after BALB／c mice infection

3．RESULTS

3．1 Viral sequences detection and virus isolation

3．2 CPE on BHK-21 cells

3．3 Identification by indirect immunofluorescence assay(IFA)

3．4 Negative-stain electron microscopy of JEV particles

3．5 Phylogenetic analysis for the full E sequences of JEV

3．6 Variation analysis for the full E sequences of JEV

3．7 The viral titer and LD50 of JEV-China／YN2016-1

3．8 Pathological changes in cerebrum of BALB／c suckling mice caused by JEV

3．9 The viral titer of JEV-China／YN2016-1 of different passage viruses

3．10 The variability of JEV-China／YN2016-1 E gene of different passage viruses

3．11 The variability of envelope gene after BALB／c mice infection with different passage viruses

4．DISCUSSION

5．Conclusion

REFERENCES

攻读博士学位期间的科研业绩

致谢