杉木木材形成过程中差异表达基因的鉴定与功能分析

摘要

木材是自然界最为重要的可再生能源，是化石燃料的潜在替代品。同时还具有重要的生态价值，它是大气碳元素长期的沉淀池，是实现生物圈各种物质循环的关键环节。 木材是需求快速增长的全球性的重要工业原材料。它是林木的主要产品。正因为木本植物重要的经济和生态价值，植物学家已经开始致力于该方面的研究。木材形成是一个关键的发育过程，具有重要的科学研究意义与应用价值。它起源于一个高度特化的组织——维管形成层，包括以下5个步骤：细胞分裂、细胞增大、细胞壁加厚、木质化及细胞程序性死亡。 随着各种新的基因组技术在林木研究中的应用，以及模式植物中不断完善的进化上保守的机制，对木材形成的分子和遗传调控机理已有了较广泛的认识。但是，这仍然是十分有限的。大部分关于木材形成的研究进展是对形成木材的组织进行EST测序分析、蛋白质组学分析以及芯片分析。 一杉木木材形成差异表达基因文库的构建和分析为了获得杉木木材形成过程中特异表达基因，本研究利用抑制差减杂交技术，以杉木突变体独干杉无性系为测试方(Tester)，正常的句容0号无性系为驱动方(Driver)，构建了正向差减文库；以杉木突变体独干杉无性系为驱动方(Driver)，正常的句容0号无性系为测试方(Tester)，构建了反向差减文库。利用macroarray技术，以正向差减、反向差减及未差减的测试方(Tester)、驱动方(Driver)四种探针，进一步筛选了差异表达克隆，从正、反向文库中分别获得了618和409个克隆。 序列测定及分析后，共获得405个uniESTs。其中40％的与已知蛋白具有显著同源性，可分为4个主要类别：新陈代谢、细胞生成和结构重构、信号传导和胁迫。定量PCR对选择的11个参与木材形成的ESTs进一步的验证，结果与macroarray数据一致。 本研究系统分析了参与杉木木材形成的基因，对了解木质部分化的分子机制具有重要意义，也是了解木材形成遗传控制的直接信息来源，为改良材性和纤维性质提供了潜在候选基因。 二细胞壁扩展相关基因的克隆和功能分析细胞壁蛋白在调控细胞壁延展性中起重要作用，而细胞壁的延展性是决定细胞扩展的关键因子。在这些壁蛋白中扩展蛋白(expansins)最为独特，它在一定的pH值下无需任何激活蛋白就能诱导体外细胞壁的伸长和体内细胞的扩展。 以杉木木材形成的特异表达基因文库中获得的扩展蛋白ESTs序列为基础，通过RLM-RACE技术成功克隆到3条全长扩展蛋白基因。其中ClEXP1 eDNA全长1033bp，包括247个氨基酸的开放阅读框(ORF)区；ClEXP2 cDNA全长1374bp，包括268个氨基酸的开放阅读框(ORF)区； ClELP1 cDNA全长1023bp，包括272个氨基酸的开放阅读框。在GenBank中的登录号分别为：EF102108、EF158813和EF192940。进化树重建结果表明，ClEXP1和ClEXP2属于a-expansin(EXPA)；ClELP1属于γ-expansin(EXLA)。 内含子—外显子结构分析发现：ClEXP1与拟南芥α-expansins(EXPA)相似，含有内含子A和B；ClEXP2含有3个内含子(A、C和F)，与拟南芥β-expansins(EXPB)更类似。实时定量PCR显示，ClEXP1和ClEXP2具有较为相同的表达模式，在形成层区域表达最高，在针叶及茎尖中度表达，成熟木质部表达较低，而根和花粉中几乎不表达；ClEXP1在形成层及针叶中均有较高的表达，在木质部及茎尖中度表达，花粉中表达较低，而根中几乎检测不到。该组基因的成功克隆，将为系统研究扩展蛋白在木材形成过程中的表达情况、功能及调控机制奠定基础。 时空表达模式表明ClEXP1和ClEXP2均在木材形成的组织形成层区域特异性表达。为了研究expansins基因在次生生长中的功能，以期获得其在木材形成过程中作用机制的生物学证据，实验在克隆了杉木木材形成组织特异表达ClEXP1和ClEXP2的基础上，利用转基因技术在烟草中分别过量表达这2个基因。35S：：ClEXP1和35S：：ClEXP2转基因烟草均呈现多效的(pleiotropic)表型：花形、花色及蒴果均有不同程度的变化；叶片变大、且比野生型至少多2片；节间伸长；高生长和粗生长显著增加。与野生型烟草植株相比，35S：：ClEXP1和35S：：ClEXP2转基因植株的纤维素含量分别增加约50％和30％。扫描电镜分析发现：髓薄壁细胞显著增大；木质部及韧皮部细胞壁局部有所加厚。 总结:ClEXP1和ClEXP2作为α-expansin(EXPA)基因家族的成员可能存在功能部分冗余现象；ClEXP1属于C亚组，可能主要参与初生生长；ClEXP2的特征序列显示其为木材形成特异表达基因，可能主要参与次生生长；ClEXP1和ClEXP2可能通过细胞壁局部加厚的方式，直接或间接参与纤维素的合成或沉积；但二者作用方式或位置可能不同，ClEXP1可能比ClEXP2的作用强。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

第一章木材形成的遗传控制

1前言

2木材的结构与组成

3木材形成的生物学过程

3.1维管形成层的起源和结构

3.2形成层原始细胞与干细胞

3.3细胞扩展

3.4次生壁的沉积

3.5木质化过程

3.6细胞程序性死亡

3.7心材的形成

4木材形成的研究方法

4.1 mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)

4.2 cDNA代表性差异分析(RDA)

4.3抑制差减杂交技术(SSH)

4.4 cDNA-AFLP

4.5蛋白质组学

5木材形成的研究系统

5.1拟南芥(Arabidopsis)系统

5.2百日草(Zinnia)叶肉细胞转分化成管状分子系统

5.3杨树(Populus)系统

5.4松树(Pinus)和桉树(Eucalyptus)系统

6木材形成的遗传调控机制

6.1调控木材形成的转录因子

6.2木质素生物合成的转录调控

6.3次生壁生物合成的转录调控网络

6.4糖基转移酶(GTs，glycosyltransferases)

7展望

参考文献

第二章罗突变体独干杉表型分析

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2水分含量测定

2.3纤维素含量测定(Updegraff 1969)

2.4木质素含量测定(Kirk and Obst 1988)

2.5纤维素和木质素的组织定位

3结果

3.1独干杉细胞壁成分发生改变

3.2木质素和纤维素的组织化学染色

4讨论

4.1木质素

4.2木质纤维素

参考文献

第三章杉木木材形成过程差异表达基因文库的构建与分析

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2 RNA Pull的制备

2.3抑制差减杂交

2.4差减文库的构建

2.5差减文库的鉴定

3结果

3.1总RNA的分离

3.2 mRNA的纯化

3.3 Rsa Ⅰ酶切结果

3.4第2次PCR扩增结果

3.5差减效率检测

3.6文库重组子鉴定

4讨论

4.1抑制差减杂交(SSH，suppression subtractive hybridization)

4.2木质化(xylogenesis)

参考文献

第四章杉木木材形成过程特异表达基因的鉴定与分析

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2试剂

2.3差异克隆筛选(Differential Screening)

2.4序列测定

2.5序列分析

2.6定量PCR验证

3 结果

3.1 Probe接头RsaⅠ酶切

3.2 Probe定量

3.3筛选(Differential Screening)差减文库

3.4差异表达克隆的测序分析

3.5定量RT-PCR验证

4讨论

4.1生长素(Auxin)可能在决定独干杉表型形成中起重要作用

4.2独干杉的细胞壁扩展(expansion)相对迟缓(inertial)

4.3细胞壁合成基因的差异调控

参考文献

第五章杉木木材形成相关扩展蛋白基因的克隆与表达分析

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2总RNA、DNA的分离

2.3引物的设计与合成

2.4目的基因全长cDNA的分离

2.5目的基因基因组全序列的鉴定

2.6目的基因基因结构的分析

2.7目的基因的表达模式

3结果

3.1扩展蛋白基因全长cDNA的克隆

3.2扩展蛋白基因的结构分析

3.3扩展蛋白基因的序列分析

3.4 α-expansin基因的系统进化树

3.5表达分析

4讨论

4.1 RACE技术

4.2 Expansins(扩展蛋白)

参考文献

第六章木材形成相关扩展蛋白ClEXP1和CIEXP2基因的功能分析

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2目的基因全长cDNA的克隆

2.3过量表达载体的构建

2.4农杆菌EHA105介导的烟草转化

2.5转基因植株的检测

2.6转基因植株的分析

3结果

3.1目的基因ClEXP1、ClEXP2的菌液PCR鉴定

3.2目的基因ClEXP1、ClEXP2酶切回收

3.3表达载体pCAMBIA 1301的双酶切

3.4 p1301-ClEXP1和p1301-ClEXP2的鉴定

3.5过量表达ClEXP1、ClEXP2的转基因烟草呈现多效的(pleiotropic)表型

3.6转基因植株内源相关基因的表达分析

3.7转基因植株纤维素含量变化

3.8转基因植株髓薄壁细胞变化

4讨论

4.1杉木expansins高度冗余且不是唯一细胞壁松弛因子

4.2过量表达杉木expansins的转基因烟草呈现多效的(pleiotropic)表型

4.3过量表达杉木expansins影响转基因烟草的细胞形态和组成

4.4 Expansins在木质细胞生长中的作用

参考文献

第七章总结

1主要结论

2存在的问题

3今后的研究方向