组蛋白H3乙酰化在热休克蛋白70基因转录调控中的作用及机制研究

摘要

基因启动子区和编码区的组蛋白乙酰化与转录激活相关，但是由于hsp70基因诱导转录时其基因上发生核小体缺失，乙酰化调控hsp70基因转录的具体机制还不十分清楚。本文通过RT-PCR，ChIP等实验手段，研究了酵母中组蛋白乙酰化在hsp70基因转录中的作用。首先ChIP实验结果表明无论核小体是否缺失，组蛋白乙酰化对于两种诱导表达的hsp70基因ssa3和ssa4的转录都是必需的。并且我们通过温度敏感实验及RT-PCR实验证明组蛋白乙酰基转移酶Gcn5和Elp3参与了hsp70基因的转录，它们的HAT活性对于其行使功能是必需的，而且它们可以直接结合到hsp70基因上，证明它们对于hsp70基因转录的调控作用是直接的。Gcn5和Elp3通过影响组蛋白H3的乙酰化水平调控ssa3和ssa4基因的转录，同时Gcn5和Elp3还能影响ssa3基因上核小体的完整性。尽管这两种组蛋白乙酰基转移酶在乙酰化组蛋白H3时具有重叠的功能，但是它们通过不同的机制影响hsp70的转录。Gcn5主要被招募到基因的启动子区，它的招募依赖Swi/Snf复合物，它影响HSF的招募及RNA聚合酶Ⅱ在基因启动子区的结合；Elp3则主要被招募到基因的编码区，它影响RNA聚合酶Ⅱ在基因上的延伸，而且它行使功能依赖于组蛋白甲基转移酶Set2。我们在TSA处理的野生型菌株和组蛋白去乙酰化酶缺失突变菌株中检测hsp70基因的表达情况，证明酵母中六种组蛋白去乙酰化酶都对hsp70基因的表达具有不同程度的调控功能。我们选择了Rpd3进行进一步的研究，实验结果表明Rpd3以Set2依赖的方式被招募到hsp70基因的编码区，通过使组蛋白H3去乙酰化来抑制hsp70基因转录的进行。我们的研究揭示了组蛋白乙酰化对hsp70基因转录的影响，为更全面的揭示组蛋白乙酰化调控基因转录的机制提供了新的实验证据，同时有助于更好的阐述hsp70基因转录调控的机制。 另一方面人的Elongator复合物在组成及与RNA聚合酶Ⅱ的作用方式上与酵母的Elongator复合物十分相似。在以前的研究中，我们利用酵母的功能补偿系统证实了人Elongator复合物中的hElp3亚基具有和酵母Elp3类似的功能，但对其在哺乳动物细胞中的功能了解较少。为了探索在哺乳动物细胞中hElp3在调控基因转录中的作用，我们用help3反义寡脱氧核苷酸片段处理293T细胞，实验结果表明help3表达的下调明显抑制了hsp70-2基因的表达，同时这一现象伴随着hsp70-2基因上组蛋白H3的乙酰化不足和RNA聚合酶Ⅱ密度降低。而且我们通过ChIP实验检测到hElp3可以被招募到hsp 70-2基因上，进一步证明hElp3对于hsp 70-2基因转录的调控作用是直接的。本文提供了hElp3在人细胞中调控hsp 70-2基因转录延伸的直接证据，为进一步揭示人Elongator复合物的功能及作用机制提供了实验证据。总之，可逆的组蛋白乙酰化修饰对hsp 70基因的转录调控具有十分重要的作用。组蛋白乙酰基转移酶Gcn5和E1p3直接参与了hsp 70基因的转录调控，它们与组蛋白去乙酰化酶的拮抗作用决定了hsp 70基因的转录状态。本论文对热休克基因hsp 70转录调控的研究，为进一步深入探讨其转录机理提供了有价值的实验证据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

一、组蛋白乙酰化修饰与真核生物基因的转录调控

(一)真核生物的染色质结构和与转录调控的关系

(二)组蛋白乙酰化修饰与转录调控

(三)组蛋白乙酰基转移酶和去乙酰化酶

二、热休克蛋白的生物学功能及其表达调控

(一)热休克蛋白的发现，分类及生物学功能

(二)热休克蛋白的表达调控

(三)Hsp70家族研究简介

(四)热休克蛋白的研究展望

第二章引言

一、本论文的研究背景和立题依据

(一)Gcn5和Elp3的研究背景

(二)立题依据

二、本文的研究内容和意义

第三章Gcn5和Elp3对ssa3和ssa4基因转录调控的影响及机制研究

一、实验材料与方法

Ⅰ.实验材料

Ⅱ.实验方法

二、实验结果与分析

(一)Gcn5全长及HAT结构域缺失突变表达质粒的构建

(二)组蛋白H3乙酰化参与了ssa3和ssa4基因的转录调控

(三)Gcn5和Elp3直接参与了ssa3、ssa4基因的转录调控，并且它们的HAT活性对于其行使功能是必需的

(四)Gcn5和Elp3影响ssa3和ssa4基因上的组蛋白H3的乙酰化

(五)RNAPⅡ与Gcn5和Elp3之间的相互作用关系

(六)HSF与Gcn5和Elp3之间的作用关系

(七)Swi/Snf与Gcn5和Elp3之间的作用关系

(八)HDAC参与了ssa3和ssa4基因的转录调控

(九)Set2影响ssa3和ssa4基因上可逆的乙酰化修饰转录调控

三、讨论

(一)核小体解体与转录结合的组蛋白乙酰化

(二)Gcn5和Elp3的功能重叠：相似和不同

(三)Swi/Snf，HSF和Gcn5之间的相互作用关系

(四)hsp70基因编码区可逆的乙酰化对其转录的影响

第四章人细胞中hElp3对hsp70-2基因转录的影响及机制研究

一、实验材料与方法

Ⅰ.实验材料

Ⅱ.实验方法

二、实验结果与分析

(一)利用反义寡脱氧核苷酸片段抑制内源help3的表达

(二)细胞内hElp3水平降低可以抑制hsp70-2基因的表达

(三)hElp3被招募到hsp70-2基因上

(四)hElp3影响hsp70-2上组蛋白H3的乙酰化

(五)hElp3影响RNAPⅡ在hsp70-2上的延伸

三、讨论

(一)hsp70-2基因转录通过染色质模板的机制

(二)hElp3调控hsp70-2基因转录的机制

主要结论

主要创新点

参考文献

附 录

致 谢

作者简历

在学期间公开发表论文及著作情况