在工程菌中过量表达龙胆IPI基因提高类胡萝卜素产量的研究

摘要

类胡萝卜素在保护人类健康方面起着重要的作用。人体不能自身合成类胡萝卜素，主要依赖从食物中摄取。大多数作物的类胡萝卜素含量较低，不能满足人体需求。在很多发展中国家，以类胡萝卜素为前体的维生素A的缺乏症发病率位于各类微量营养素缺乏症之首，参与视黄斑合成的玉米黄质，预防肿瘤的番茄红素等类胡萝卜素的缺乏问题也十分严重。目前类胡萝卜素缺乏症患者主要通过化学合成的类胡萝卜素进行补充。但化学合成类胡萝卜素存在很多弊端，如工艺复杂，产物种类较少；得到的最终产品是目标产物及其衍生物的混合物，有不可预知的副作用；长期服用对健康不利等。利用基因工程手段，在生物体内合成类胡萝卜素有效克服了这些弊端。生物合成类胡萝卜素的产物种类丰富，生产工艺简单，不会产生自然界中不存在的衍生物，补充方法简便易行，发展前景也较为广阔。目前多种微生物和高等植物中类胡萝卜素的合成途径已基本清晰。合成途径中几乎全部酶基因已得到分离和克隆，这为进一步的基因操作做了很好的铺垫。 龙胆异戊二烯焦磷酸异构酶(IPI)cDNA核苷酸序列总长度为1146bp，含有一段708bp的不间断开放可读框(ORF)，197bp的5'末端和241bp的3’末端非翻译区。在终止密码子(TGA)和多聚腺苷酸之间没有poly(A)加尾信号(AATAAA)。龙胆IPI基因编码一个含235个氨基酸残基的蛋白质，分子量为27kD，等电点为4.84。本研究应用基因工程技术，分别在能够合成番茄红素、beta-胡萝卜素、玉米黄质的工程大肠杆菌中过量表达龙胆IPI基因，以鉴定其功能，并确定它是否为类胡萝卜素合成途径中的关键酶。然后分别在工程大肠杆菌中过量表达玉米1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、龙胆beta-胡萝卜素羟化酶(BCH)。对比DXR、IPI过量表达对番茄红素、beta-胡萝卜素积累量的影响，及BCH、DXR和IPI过量表达对玉米黄质积累量的影响，以寻求更大限度产出目标类胡萝卜素的转化方式。本研究利用较易于基因操作的工程大肠杆菌作为实验对象，在较短周期内即可达到鉴定目的。若证明过量表达IPI确实可以提高类胡萝卜素含量，就可以进一步在酵母和高等植物中过量表达IPI，研发出富含类胡萝卜素的转基因酵母和转基因农作物。酵母是较易于制成保健品的单细胞蛋白，可以工业化生产：农作物更可以在日常生活中直接食用，达到健康方便的补充类胡萝卜素的目的。结果表明，过量表达IPI可以大幅度提高转基因大肠杆菌中类胡萝卜素的积累量，IPI是类胡萝卜素合成途径中的关键酶。若干转化方式中，在含有pACCRT-EBIeu质粒的大肠杆菌中过量表达IPI使番茄红素含量增加最多，达到1953.75 μg/gDW<'①>，是对照组的4.51倍；在含有pACCAR16△crtX质粒的大肠杆菌中过量表达IPI使beta-胡萝卜素含量增加最多，达到2266.24 μg/gDW，是对照组的6.53倍；在含有pACCAR25△crtX质粒的大肠杆菌中同时过量表达IPI和BCH使玉米黄质含量增加最多，达到9341.51 μg/gDW，是对照组的19.95倍。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1龙胆异戊二烯焦磷酸异构酶简介

1.2类胡萝卜素功能简介

1.3细菌及高等植物类胡萝卜素的合成途径

1.3.1高等植物类胡萝卜素的合成途径

1.3.2细菌类胡萝卜素的合成途径

1.4细菌、酵母、高等植物类胡萝卜素基因工程研究进展

1.4.1大肠杆菌类胡萝卜素基因工程研究进展

1.4.2酵母类胡萝卜素基因工程研究进展

1.4.3高等植物类胡萝卜素基因工程研究进展

1.5本研究的目的及意义

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2试剂及培养基

2.2实验方法

2.2.1感受态大肠杆菌DH5-α的制备

2.2.2质粒DNA的小量制备

2.2.3质粒DNA的酶切及电泳检测

2.2.4质粒DNA的共转化和IPTG诱导表达

2.2.5番茄红素的萃取与含量测定

2.2.6 beta-胡萝卜素的萃取与含量测定

2.2.7玉米黄质的萃取与含量测定

3结果

3.1龙胆IPI核苷酸序列及氨基酸序列的分析

3.1.1龙胆IPI核苷酸序列及由cDNA推导的氨基酸序列

3.1.2龙胆IPI蛋白的氨基酸组成分析

3.1.3龙胆IPI蛋白的亲疏水性分析

3.2质粒DNA的共转化

3.3龙胆IPI和玉米DXR对工程大肠杆菌番茄红素积累量的影响

3.4龙胆IPI和玉米DXR对工程大肠杆菌beta-胡萝卜素积累量的影响

3.5龙胆IPI、玉米DXR和龙胆BCH对工程大肠杆菌玉米黄质积累量的影响

3.5.1龙胆IPI与玉米DXR对工程大肠杆菌玉米黄质积累量的影响

3.5.2龙胆BCH对工程大肠杆菌玉米黄质积累量的影响

3.5.3龙胆IPI、玉米DXR与龙胆BCH共转化对工程大肠杆菌玉米黄质积累量的影响

4讨论

4.1龙胆IPI基因编码的蛋白同源序列的进化分析

4.2龙胆IPI信号肽分析

4.3生物合成类胡萝卜素工业化的讨论

5结论

参考文献

致 谢

在学期间在GenBank登录基因情况