HSP70对HO诱导的乳鼠心肌细胞凋亡过程中钙稳态调控的进一步研究

摘要

热休克蛋白70（Heatshockprotein70，HSP70）属于细胞内分子伴侣蛋白，除涉及细胞内一些蛋白质分子构象和稳定性的调节之外，热休克蛋白对细胞应激、代谢、增殖以及凋亡等生理过程均具有重要的调控作用。但是对于HSP70对于ROS引起的心肌细胞凋亡延迟保护作用目前在分子细胞机制上仍然不清楚。本实验以体外培养的乳鼠心肌细胞为研究对象，用温度诱导热休克蛋白（HSP70）来模拟预适应，H2O2建立细胞的ROS损伤模型，主要从分子和细胞机制上探讨HSP70对于心肌凋亡中钙离子的调控作用。实验中应用MTT和流式细胞技术检测细胞的凋亡，发现损伤组的存活率明显低于其他2组，热休克组（Heatshockgroup，HSgroup）细胞存活率略低于正常组（CONgroup）细胞；免疫组化结果表明只有在HS组才检测到阳性反应，即是HSP70的表达，其他2组均为弱阳性结果；应用离子成像技术对细胞内钙离子浓度进行测定，发现损伤组290．6918+8．922（nM）明显高于正常组192．224±6．654（nM）和HS组214．2633±4．484（nM），HS组细胞内的钙离子浓度略高于正常组；为了进一步探讨HSP70对于ROS引起的心肌凋亡过程中钙离子的调控机制，又对各组的心肌细胞进行了钙瞬变的测定。实验结果表明，H2O2单纯损伤组的心肌细胞胞浆内的钙瞬变发生明显改变，主要表现为：钙瞬变时程的明显延长，钙瞬变发生的速率明显减慢，并且由SR释放的钙离子明显增多（约43．19％），钙瞬变的消逝速率也明显延长，进而导致心肌细胞内的钙超载和心肌细胞的自发性收缩减慢：进行HSP70过度表达的HS组钙瞬变过程对H2O2造成的损伤有明显的修复作用，主要表现为：钙瞬变的时程比损伤组有明显减少，SR释放的钙离子有显著的降低（约15．93％），钙瞬变消逝的速率也明显加快，说明HSP70对SR上相关的RyR进行了修复，使得释放的钙离子减少，并且对NCX进行了修复使得钙的跨膜转运加快，从而对心肌细胞的收缩起到一定的保护作用，但是对于H2O2造成的钙调控位点的损伤并不能完全修复，所以对比CON组还是有所损伤。HSP70这种内源性自发的调控对于自由基损伤过程中钙的调控还是起到明显作用的。这些结果将对HSP70对于ROS引起的心肌细胞凋亡的保护作用过程中的分子机制，至少是钙超载过程中的调控机制和心肌收缩性的恢复过程提供一定的证据。

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引 言

1热休克蛋白70(HSP70)的概况和作用

1.1热休克蛋白(HSP)的发现与分类

1.2热休克蛋白70的分子生物学作用

1.3 HSP70对心肌的保护作用

2 HSP70对心肌保护作用的研究进展

材料与方法

1实验材料

1.1实验动物

1.2药品与试剂

1.3实验仪器

2实验方法

2.1乳鼠心肌细胞的原代培养

2.2 MTT比色法测定心肌细胞的凋亡

2.3流式细胞技术——Annexin V-FITC双染法测定心肌细胞的凋亡

2.4心肌细胞内的HSP70测定

2.5心肌细胞内钙离子浓度的测定

2.6心肌细胞内钙瞬变的测定

3统计学处理方法

实验结果

1 H2O2导致的乳鼠培养心肌细胞凋亡

2 H2O2导致的乳鼠培养心肌细胞内钙离子浓度的变化

3 HSP70在培养乳鼠心肌细胞各组中的表达

4心肌细胞内胞浆钙瞬变的变化

讨 论

1 H2O2对大鼠乳鼠心肌细胞的损伤作用

1.1 H2O2诱导大鼠乳鼠心肌细胞损伤模型的建立

1.2 H2O2在心肌细胞凋亡过程中导致了心肌细胞的钙超载

2 HSP70在H2O2诱导凋亡的心肌细胞上的表达

3 HSP70对于H2O2诱导的心肌细胞钙超载的调节

3.1 HSP70对心肌细胞损伤蛋白的修复作用

3.2 HSP70对钙瞬变过程的修复作用

结 论

创新点

参考文献

致 谢