NPA motifs与水通道蛋白AQP4质膜定位关系的研究

摘要

水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是在原核和真核细胞的细胞膜上表达的快速转运水的特异性蛋白孔道。迄今为止哺乳动物中已克隆的水通道蛋白家族有13个成员(AOPO-AQP12)。对人类AQPs基因突变和应用AQPs基因敲除小鼠进行的大量研究表明水通道蛋白在体内液体转运的生理过程中起重要作用。除此之外,水通道蛋白还参与细胞的增殖、迁移和凋亡等一些重要生命活动。AQP4是中枢神经系统中表达最丰富的水通道蛋白,主要定位在室管膜细胞、与血脑屏障的毛细血管紧密相连的星形胶质细胞的终足以及与突触相接触的终足上。AQP4基因敲除小鼠的研究表明,AQP4与脑脊液的平衡密切相关。
　　 随着对AQPs基因功能的研究正在不断深入,AQPs基因中特殊的结构域与其细胞定位和生物合成之间的关系也成为研究的热点。在绝大多数组织细胞中,AQPs的家族成员都在细胞膜上表达。然而,水通道蛋白AQP2、AQP11和AQP12是个例外。尽管在肾脏集合管细胞内表达的 AQP2在抗利尿激素的调节下也可以转运至细胞顶膜表达。水通道蛋白家族成员间序列各不相同(彼此之间有30％相似性),但基本上所有的水通道蛋白家族成员都具有两个高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸序列(Asn-Pro-Ala,NPA motifs)。晶体结构研究显示,两个NPA motifs位于通道中央狭窄部位,对于水分子选择性通过通道具有关键性作用,它们共同组成了水分子或中性小分子通过的孔道。有意思的是,AQP11和AQP12只具有一个NPA motif结构,它们的第二个NPA motif分别被NPC和NPT所取代,提示NPA motifs对于水通道蛋白的质膜定位至关重要。
　　 由于AQP4具有两个翻译起始位点M1和M23,因此编码的蛋白有AQP4-M1和AQP4-M23两种亚型,分别含有323和301个氨基酸。AQP4的晶体结构研究表明,在孔道正中央的NPA motifs中的两个 Asn各自将氢原子提供给两个水分子,使得两个Asn与中间的两个水分子分别形成氢键。这与在AQP1晶体结构中发现的两个Asn将氢原子提供给同一个水分子完全不同。然而,NPA motifs作为水通道蛋白家族进化中高度保守的序列在AQP4细胞内加工成熟中的作用目前尚不清楚。
　　 本研究对AQP4基因序列中高度保守的NPA motif与水通道蛋白AQP4质膜定位和生物合成的关系进行了研究,并且对AQP4-M1和AQP4-M23两种亚型的AQP4蛋白在生物合成中有无异同进行了初步的探索。
　　 在本研究中我们采用点突变和细胞转染技术对两种水通道蛋白 AQP4-M1和AQP4-M23中 NPA motif在生物合成中的作用进行了研究。为确定NPA motifs在AQP4生物合成和细胞质膜定位过程中是否发挥作用,发挥着怎样的作用,以及M1和M23亚型的AQP4在这个过程中有没有差别等问题,我们制备了带有GFP标记的一系列NPAmotifs缺失和单个氨基酸替换的突变体,并将其在不同的细胞系中进行表达,采取免疫印迹和免疫荧光技术进行检测。研究结果表明,NPA motifs在 AQP4的质膜定位中发挥关键作用,但不影响 AQP4的生物合成。同时提示水通道蛋白家族中 NPA motifs与其它结构域相互作用共同参与调节水通道蛋白的质膜定位过程。

目录

文摘

英文文摘

第一部分引言

一、水通道蛋白的发现、命名和分类

二、水通道蛋白的溶质转运

(一)甘油和尿素

(二)阴离子

(三)氨和过氧化氢

(四)亚砷酸盐和辉锑盐

(五)CO2和NO气体

三、水通道蛋白AQPs的结构与其通透性机制

(一)水通道蛋白AQPs的结构

(二)水通道蛋白AQP1的转运选择性与通透性机制

四、水通道蛋白AQP4的结构与某些生理疾病的关系

(一)AQP4结构的基本特征

(二)AQP4与OAP

(三)AQP4与脑水肿

(四)AQP4与视神经脊髓炎

五、NPA Motifs与水通道蛋白AQP4质膜定位的关系尚不清楚

六、本研究的目的和意义

第二部分材料与方法

一、实验材料

(一)主要生化和分子生物学试剂

(二)主要实验仪器、耗材及数据分析软件

二、实验方法

(一)大鼠AQP4-M1和AQP4-M23 cDNA的克隆

(二)大鼠pEGFP-N1-AQP4-M1和pEGFP—N1-AQP4-M23真核表达载体的构建

(三)NPA motifs缺失突变体的构建

(四)AQP4单个氨基酸替换的突变体构建

(五)细胞转染

(六)免疫荧光

(七)免疫印迹

第三部分实验结果

一、大鼠AQP4-M1和AQP4-M23 cDNA的克隆

(一)大鼠脑和肾脏组织总RNA的提取

(二)RT-PCR

二、大鼠pEGFP—N1-AQP4-M1和pEGFP—N1-AQP4-M23真核表达载体的构建

三、大鼠pEGFP—N1-AQP4-M1和pEGFP—N1-AQP4-M23突变体的构建

(一)NPA缺失突变体的构建

(二)氨基酸替换突变体的构建

四、大鼠AQP4-M1和AQP4-M23一系列突变体的细胞转染

(一)AQP4-M23突变体在CHO和COS7细胞中的转染

(二)AQP4-M1和AQP4-M23突变体在FRT细胞中的转染

五、大鼠AQP4-M1和AQP4-M23一系列突变体蛋白的免疫印迹

第四部分讨论

一、NPA motifs在AQP4的生物合成和质膜定位中起关键作用

二、AQP4-M1 N-末端的22个氨基酸与第一个NPA motif存在相互作用

第五部分结论

参考文献

英文缩写词

致谢

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