栽培大豆非生物胁迫诱导的蛋白激酶基因GmGSK的克隆及功能分析

摘要

高盐、干旱、低温等非生物胁迫是影响作物产量的重要环境因素。植物通过长期进化逐渐形成特定的机制来抵御外界环境造成的胁迫,减轻对自身的伤害。其中蛋白激酶可通过对底物可逆的磷酸化来参与胁迫信号的传导,从而进一步调节外界胁迫对作物造成的伤害。因此,蛋白激酶在植物的抗逆途径中起到了非常重要的作用。
　　 我们以小麦的TaGSK1基因序列为探针,通过电子克隆在栽培大豆中得到一条类似糖原合成酶激酶的cDNA序列,并通过RT-PCR的方法将其克隆。序列分析表明,此cDNA包含一条1230bp的完整开放阅读框,编码410个氨基酸,估计的分子量为46.5kD,等电点PI为8.64。蛋白序列分析表明,其编码一个与GSK-3同源的蛋白,含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点,命名为GmGSK(Genbank登录号:FJ460228)。
　　 Southern杂交表明,GmGSK基因在栽培大豆基因组中至少有两个拷贝。Northern杂交显示,在栽培大豆的根、茎、叶、叶柄及子叶中均能表达GmGSK,但不同的组织器官中GmGSK基因的表达量不同,在根中分布较多。半定量RT-PCR分析结果显示,GmGSK基因的表达可以被NaCl、NaHCO3、干旱、ABA和低温所诱导,这表明GmGSK可能参与了大豆非生物胁迫的信号传导过程或对非生物胁迫的耐受。
　　 利用pCAMBIA1302构建GmGSK:GFP融合载体,通过农杆菌渗入法在烟草中叶片细胞中瞬时表达GmGSK:GFP融合蛋白。对GmGSK进行亚细胞定位发现,其分布在细胞膜与细胞质中。为了进一步研究其功能我们分别将其转入大肠杆菌(BL21)和酿酒酵母(INVScl)中,原核表达显示其蛋白大小确为46.5kD左右；在转GmGSK基因的酿酒酵母中,其对NaCl、NaHCO3和干旱等非生物胁迫的耐受能力明显强于非转基因酿酒酵母。
　　 最后,通过构建pCAMBIA3300-GmGSK植物双元表达载体,将GmGSK转入烟草,过量表达GmGSK基因,验证其在植物中的生物学功能。结果表明,在高盐胁迫下转基因植株的生长状态、相对生物量、根系发达程度与对照相比均得到了明显的提高。对转基因烟草和非转基因烟草植株共同浇灌适当浓度NaCl,结果显示转基因烟草能明显提高对高盐的耐受性,而非转基因烟草则在不久后死亡。对其生理指标进行测定显示,在盐胁迫下转基因烟草的可溶性糖含量增长幅度明显快于非转基因对照,而外渗相对电导率增长速率则明显慢于非转基因对照,这些有助于提高转基因烟草的耐盐性。
　　 以上结果表明,栽培大豆GmGSK基因在生物抵御外界非生物胁迫过程中有重要作用,过量表达GmGSK基因,能显著提高生物的抗逆性,这也为将来利用耐盐基因改善栽培大豆耐盐性方面,提供了一条新途径。

目录

文摘

英文文摘

引言

1植物蛋白激酶研究进展

1．1植物蛋白激酶

1．2植物蛋白激酶家族的分类

1．3植物蛋白激酶的结构

1．4植物蛋白激酶的生理功能

1．5研究展望

2糖原合成酶激酶(GSK-3)研究进展

2．1 GSK-3的类型

2．2 GSK-3的结构和生物特性

2．3 GSK-3的生物学功能

2．4研究展望

3立题依据及研究目标

3．1立题依据和背景

3．2研究目的和意义

3．3研究目标与内容

材料与方法

1实验材料

1．1植物材料

1．2菌种与质粒

1．3主要分子生物学试剂

1．4缓冲液及主要试剂配制

1．5主要仪器

2实验方法

2．1 GmGSK基因的克隆与鉴定

2．2 GmGSK基因在栽培大豆中的表达

2．3 GmGSK的亚细胞定位

2．4大豆GmGSK基因在大肠杆菌中的表达

2．5大豆GmGSK基因在酿酒酵母中的表达

2．6 GmGSK基因在烟草中的表达及其相关功能鉴定

结果与分析

1 GmGSK基因的克隆与序列分析

1．1 GmGSK基因的克隆

1．2测序及序列生物信息学分析

1.3GmGSK基因的Southern杂交分析

2 GmGSK基因在栽培大豆中的表达分析

2．1 GmGSK在大豆不同器官的表达

2．2 GmGSK在不同胁迫条件下的表达

3 GmGSK基因的亚细胞定位分析

3．1表达载体构建与验证

3．2渗入法表达融合蛋白

3．3激光共聚焦显微镜观察

4大豆GmGSK基因在大肠杆菌中的表达分析

4．1含GmGSK基因的原核表达载体构建与验证

4．2蛋白质表达产物的获得和鉴定

5大豆GmGSK基因在酿酒酵母中的表达分析

5．1含GmGSK基因的酿酒酵母表达载体构建与验证

5．2 pYES2-GmGSK的酵母转化及鉴定

6 GmGSK基因在烟草中的表达及其相关功能分析

6．1含GmGSK基因的植物双元表达载体构建与验证

6．2转基因烟草的耐盐性鉴定

讨论

1电子克隆技术的应用

2 GmGSK基因的生物信息学分析

3 GmGSK基因的特异性表达分析

4用农杆菌渗入法(Agroinfiltration)进行亚细胞定位

5 GmGSK的转基因研究

结论

参考文献

附录

致谢

在学期间公开发表论文及著作情况