液相芯片技术检测耐多药结核分枝杆菌方法研究

摘要

结核分枝杆菌耐药性的检测在预防和治疗结核病过程中具有十分重要的意义。从我国国情出发，需要建立一种快速有效、成本低廉的耐多药结核分枝杆菌检测方法。
　　本文设计了含有耐药突变基因的质粒，模拟耐药结核杆菌的不同基因突变类型，将液相芯片技术与等位基因特异性引物延伸反应相结合，对耐多药结核分枝杆菌的检测方法进行研究。确定了方法的最佳反应体系，可以同时对多个突变基因进行检测，各基因位点之间不存在信号干扰，最低检测浓度可达1ng/mL；重复性实验表明，对不同基因突变形式检测的变异系数（CV）为6.72％-12.77%。本研究建立的耐多药结核杆菌的检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快、价格低廉、高通量等特点，极具临床应用潜力。

目录

声明

第一章 绪 论

1.1 结核病简介

1.1.1 结核病的产生

1.1.2 结核病的基本现状

1.1.3 耐药结核病的分类

1.1.4 结核病的主治药物

1.1.5 结核杆菌的耐药机理

1.2 检测结核病耐药性的常用方法

1.2.1 药物敏感性试验法

1.2.2 直接测序法

1.2.3 聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)

1.2.4 PCR-线性探针杂交技术

1.2.5 固相芯片法

1.3 Luminex液相芯片技术

1.3.1 Luminex液相芯片技术原理

1.3.2 Luminex xTAG技术

1.3.3 液相芯片技术的优势及其应用

1.4 本研究实验设计

1.4.1 研究目的和意义

1.4.2 实验设计

第二章 液相芯片技术检测耐多药结核分枝杆菌方法建立

2.1 实验材料

2.1.1 材料

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂

2.1.4 实验溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 检测序列信息

2.2.2 感受态细胞的制备

2.2.3 含有检测模板的质粒转化

2.2.4 质粒的提取

2.2.5 PCR扩增反应

2.2.7 ASPE反应

2.2.8 荧光微球杂交

2.2.9 Luminex 200仪器校正

2.2.10 样品检测

2.2.11 反应条件优化

2.3 实验结果

2.3.1 质粒含量检测结果

2.3.1 PCR扩增及反应体系优化结果

2.3.2 PCR扩增产物纯化结果

2.3.3 Tsp DNA聚合酶浓度优化结果

2.3.4 荧光微球浓度优化结果

2.3.5 链霉亲和素藻红蛋白浓度优化结果

2.3.6 链霉亲和素藻红蛋白杂交时间优化结果

2.3.7 8种重组质粒的检测结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 液相芯片技术检测耐多药结核分枝杆菌可靠性研究

3.1 实验材料

3.1.1 材料

3.1.2 主要仪器

3.1.3 主要试剂

3.1.4 实验溶液的配制

3.2 方法

3.2.2 重复性实验

3.3 结果

3.3.1 灵敏度检测

3.3.2 重复性检测

3.4 讨论

3.5 小结

结论

致谢

参考文献