冬季湿地植物的筛选、再生体系建立及ACDS基因载体构建

摘要

目前在亚热带地区应用的湿地植物在冬季大多数会死亡或地上部分停止生长,普遍存在生物量小、导致吸附总量不足的问题,本文通过筛选25种在冬季能安全越冬具有一定的去污能力的植物,并建立水芹与德国鸢尾的再生体系,同时构建ACC脱氨酶(ACDS)基因表达载体。主要研究结果如下:
　　 1.为了建立一套科学的冬季湿地植物筛选与净化潜力评价体系。以25种湿地植物为材料,在综合应用原有各种湿地植物筛选与评价指标的基础上,增加植物逆境酶和基质酶,对所有指标进行聚类分析。结果表明,25种植物的根系数量、长度、活力、叶片过氧化物酶活性、生长量、氮磷平均浓度、氮磷的积累能力存在一定的差异,根系附近基质脲酶活性与磷酸酶活性也存在一定的差异。根据净化潜力的综合评价体系,可以把25种植物聚类为6大类,净化潜力由强到弱依次为:水芹、油菜、灯芯草、虎耳草、桂花和剩余19种植物。
　　 2.以净化潜力较强的德国鸢尾和水芹最为受体植物,进行再生体系建立与优化。
　　 (1)德国鸢尾:以种子胚获得的无菌苗为外植体,愈伤组织的诱导和继代培基为MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+2,4-D0.1mg·L-1,诱导率最高可达60.5％。在此过程中,添加100 mg·L-1的活性炭、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Na2S2SO4、Vc等均能抑制德国鸢尾愈伤组织的褐化现象,活性炭的抑制效果最好。愈伤组织分化最适培养基为:MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1,继代天数为49d。诱导德国鸢尾不定芽生根的最适培养基为:1/2MS+IBA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1；平均根长4.25cm。移栽至田土+泥炭+河沙=1:1:1或者珍珠岩+泥炭=3:7,成活率达95％,苗长势较好。
　　 (2)水芹:以水芹茎尖生长点为外植体,愈伤组织的诱导和继代培养基为MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+2,4-D0.1mg·L-1,诱导率最高可达67.5％。在此过程中,添加剂100 mg·L-1的活性炭、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Na2S2SO4、Vc等均能抑制德国鸢尾愈伤组织的褐化现象,活性炭的抑制效果最好。愈伤组织分化最适培养基为:MS+6-BA0.2mg.L-1+NAA0.05mg·L-1,继代天数为42d。诱导水芹不定芽生根的最适培养基为:1/3MS+IAA0.6mg·L-1+NAA0.05mg·L-1；平均根长4.45cm。移栽至炉灰渣+蛭石+细沙=1:1:1或者珍珠岩+蛭石=2:3,成活率达95％,苗长势较好。
　　 3.构建ACC脱氨酶(ACDS)基因表达载体。采用改良的小量细菌总DNA提取法,从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)UW4菌株提取细菌总DNA,根据已报道的阴沟肠杆菌ACDS的序列设计并合成一对简并引物,通过PCR扩增获得一条约1020bp特异片段,把该片段连接到pCR2.1-TOPO vector上进行克隆测序。序列分析结果表明该基因编码区全长为1017bp,共编码338个氨基酸残基,与GenBank中报道的序列(AF047710)相比仅存在5个核苷酸的差异,一致性高达99.1％。并且以CaMV35S为启动子构建ACDS的植物表达载体。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 处理生活污水冬季湿地植物研究现状

1.1.1 湿地植物的性质

1.1.2 冬季湿地植物的简述

1.1.3 冬季湿地植物的研究中存在的问题

1.2 处理生活污水的冬季湿地植物的筛选

1.2.1 植物在人工湿地中的作用

1.2.2 人工湿地植物的选择原则

1.2.3 影响湿地植物净化污水效果的因素

1.2.4 湿地植物的筛选与净化潜力的研究进展

1.3 冬季湿地植物再生体系建立

1.4 ACC脱氨酶基因及其应用

1.4.1 ACC脱氨酶的基因特征

1.4.2 ACC脱氨酶的作用机理

1.4.3 ACC脱氨酶的应用

1.5 本研究的目的与意义

1.6 课题来源及主要研究内容

2 冬季湿地植物的筛选与净化潜力评价

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要实验仪器与试剂

2.1.3 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 湿地植物的适应能力与生理特性

2.2.2 湿地植物的耐污与去污能力

2.2.3 湿地植物的聚类分析与净化潜力的综合评价

2.3 讨论

3 两种冬季湿地植物再生体系的建立

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要实验仪器与试剂

3.1.3 实验方法

3.2.结果与分析

3.2.1 外植体最佳消毒方法的选择

3.2.2 激素种类及浓度的确定

3.2.3 愈伤组织的诱导

3.2.4 愈伤组织的继代

3.2.5 愈伤组织的分化

3.2.6 不定芽的生根

3.2.7 再生植株的驯化移栽

3.3 讨论

3.3.1 无菌体系的建立

3.3.2 植物生长调节剂的作用

3.3.3 褐化原因及吸附剂的作用

4 ACDS基因克隆及载体构建

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 主要实验仪器与试剂

4.1.3 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 ACDS基因的克隆

4.2.2 ACDS基因表达载体的构建

4.3 讨论

5 结论、创新与展望

5.1 主要研究结论

5.2 创新点

5.3 研究展望

参考文献

附图

附录 A:攻读硕士学位期间主要学术成果

附录 B

致谢