油茶泛素结合酶E2基因全长cDNA克隆及其RNAi干扰载体的构建

摘要

油茶(Camellia oleifera)是一种多年生木本科油料作物，是我国重要的木本食用油料树种。茶油主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸组成，其含量一般在90％以上，是当前国内最受欢迎的高营养价值的食用油之一。由于油茶种子的发育过程处于南方高温、干旱天气，土壤贫瘠等生理环境，因此油茶在生长发育过程中，会遭受到一些非生物胁迫，如干旱、重金属、营养缺乏、高盐，病虫害、高温或低温等。介导蛋白质特异降解的泛素/26S蛋白酶体途径显著影响着植物的生长发育，泛素结合酶E2作为该途径中的一个关键酶，对植物的细胞周期调控、植物衰老、细胞分化、激素信号响应、光形态建成及非生物胁迫响应等产生了重要的影响。本研究在已有的油茶种子cDNA文库及EST文库的基础上，对油茶E2基因进行全长cDNA的克隆和生物信息学分析，并构建了植物RNAi干扰载体。主要研究结果如下：
　　 1、油茶E2基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析。从本实验室油茶cDNA文库中鉴定出一条E2基因的全长cDNA，该基因长度为804bp，经与核酸数据库进行比对分析，确定为E2基因，该基因编码152个氨基酸。应用一系列生物信息学分析方法对其等电点、分子量、跨膜结构、疏水性、二级结构等进行预测分析，结果显示：E2蛋白质的分子量为17．4KDa，等电点为5．40。E2整个蛋白的疏水指数从—3．633到2．122，其中除在37位、102位以及105位氨基酸表现出疏水性，整条多肽链表现出亲水性。E2蛋白有两个不明显的跨膜区。二级结构预测发现油茶E2蛋白二级结构以α螺旋结构为主，不规则卷曲散布于整个蛋白质中。油茶E2蛋白第77～92位为泛素结合酶活性位点，其中活性位点中的半胱氨酸位于第88位。
　　 2、油茶E2基因的RNAi干扰载体构建。采用片段替换方法构建了中间载体pMD19—Dimer。根据油茶E2基因的序列特点，设计引物克隆了RNAi干扰载体片段。将干扰片段依次插入到中间载体pMD19—Dimer上。检测RNAi中间载体构建成功后，用引物XbaⅠ和SacⅠ分别双酶切pMD19—Dimer—E2—RNAi和植物载体pBI121，回收连接，构建植物干扰载体pBI—E2—RNAi。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

1 绪论

1.1 油茶的概述

1.2 油茶的育种与栽培研究

1.3 油茶的分子生物学与细胞生物学的研究进展

1.3.1 油茶的分子标记研究

1.3.2 油茶的cDNA文库和EST文库的构建

1.4 泛素-26S蛋白酶体途径

1.5 泛素化过程

1.5.1 泛素(Ubiquitin,Ub)

1.5.2 泛素连接级联反应

1.5.3 26S蛋白酶体

1.5.4 去泛素化酶(deubiquitination enzymes,DUBs)

1.6 泛素/26s蛋白酶体途径的生理功能

1.6.1 泛素/26s蛋白酶体途径与生长素响应

1.6.2 泛素/26s蛋白酶体途径与光形态建成

1.6.3 泛素/26s蛋白酶体途径与非生物胁迫抗性

1.7 泛素结合酶E2的研究进展

1.7.1 泛素结合酶E2的属性与分类

1.7.2 泛素结合酶E2功能的研究进展

1.8 本研究的意义、主要内容和技术路线

2 油茶泛素结合酶E2基因克隆与序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 目的基因的PCR检测

2.2.2 油茶泛素结合酶基因全长cDNA克隆及序列分析

2.2.3 油茶E2蛋白质理化性质分析

2.2.4 油茶E2蛋白质高级结构预测

2.3 讨论

3 油茶E2基因RNAI载体的构建

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 RNAi载体干扰片段的制备

3.2.2 中间载体pMD19-Dimer的构建

3.2.2 中间载体pMD19-Dimer-E2-RNAi的构建

3.2.3 油茶E2基因RNAi载体的构建

3.3 讨论

3.3.1 目的片段引物的设计和克隆

3.3.2 中间载体的改造

3.3.3 RNAi干扰载体的构建

4 结论与创新

4.1 结论

4.2 创新点

参考文献

附录 A:主要试剂的配制

附录 B:攻读学位期间的主要学术成果

致谢