南方红豆杉细胞悬浮培养产紫杉醇的研究

摘要

南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)是红豆杉科红豆杉属在中国的一个变种，其紫杉醇含量是该属中较高的一种。但由于南方红豆杉野生资源稀少，紫杉醇的产量有限，远不能满足市场对紫杉醇的需求。近年来，南方红豆杉组织培养和细胞培养的研究受到广泛关注，诱导愈伤组织外植体的选择、诱导愈伤组织培养基的优化、愈伤组织继代过程中褐化问题的解决、产紫杉醇悬浮细胞体系的建立及产紫杉醇条件的优化等已成为研究的重点。本研究以南方红豆杉优良植株为材料，首先筛选诱导愈伤组织的外植体，然后优化诱导愈伤组织的培养基，接着寻求解决褐化问题的方法，最后优化产紫杉醇的条件，获得的主要结果如下：
　　 (1)诱导南方红豆杉愈伤组织外植体的筛选。选取叶片、不带叶茎段、带叶茎段和成熟胚4种外植体，将其分别培养在附加有适宜浓度NAA和6－BA的B5培养基上。结果表明叶片、不带叶茎段、带叶茎段和成熟胚都可以诱导出愈伤组织，但是叶片和带叶茎段产生愈伤组织的时间较晚、形成的愈伤组织较小且叶片的诱导率较低；不带叶茎段和成熟胚形成的愈伤组织颜色不同，前者浅绿，后者透明淡白，且前者愈伤组织的诱导率高于后者。综合可知上述4种外植体诱导愈伤组织效果的顺序为：不带叶茎段>成熟胚>带叶茎段>叶片。
　　 (2)诱导南方红豆杉愈伤组织培养基的优化。以不带叶茎段和成熟胚为外植体，以B5、1/2WPMSH、1/285SH为基本培养基，以NAA、6－BA、2，4－D为附加激素。结果表明不带叶茎段在B5培养基上生长较好，且诱导愈伤组织较好的培养基组合为：B5+NAA1.0mg/L+6－BA0.5 mg/L；而成熟胚在1/2WPMSH培养基上生长较好，它诱导愈伤组织较适宜的培养基组合是：1/2WPMSH+2，4－D1.5mg/L+6－BA0.5mg/L。经过比较后发现，前者形成的愈伤组织为绿色且结构较致密，而后者形成的愈伤组织为白色且结构较为松散。
　　 (3)不同添加物对愈伤组织褐化的影响。以不带叶茎段和成熟胚为外植体，在上述两种最佳组合中添加不同浓度的活性炭、VC和水解酪蛋白。结果表明三者都可以在一定的程度上缓解褐化现象，且减轻褐化的能力为：活性炭>水解酪蛋白>VC；但是添加了活性炭的培养基中愈伤组织的生长明显变慢，可能是因为活性炭在吸附愈伤组织分泌的多酚等物质的同时也吸附了培养基中的营养成分，综上所述认为向培养基中添加水解酪蛋白是缓解褐化的较好方法。
　　 (4)细胞悬浮培养产紫杉醇条件的优化。用不带叶茎段和成熟胚诱导的并继代了5代的愈伤组织进行细胞悬浮培养，以较适宜组合为液体培养基，改变培养基中蔗糖的初始浓度，考察初始糖浓度对细胞生长的影响，结果表明：细胞生长较适的初始糖浓度为30％。在整个细胞悬浮培养过程，细胞的生长曲线呈“S”型；在稳定期测得悬浮体系中累积的紫杉醇含量约为13.0μg/mL；在显微镜下观察到南方红豆杉的细胞多数呈圆形或椭圆形。