珙桐种群遗传多样性与分子谱系地理学研究

摘要

珙桐(Davidia involucrate Baill)系我国特有的单型属植物，是第三纪古热带植物区系孑遗种，被列为国家一级保护植物，为世界著名的观赏木本植物，在植物系统发育和地史变迁上具有很高的研究价值。本研究采用ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)分子标记和叶绿体DNA非编码序列标记研究珙桐天然分布区11个种群的遗传多样性和分子谱系地理学，旨在探讨珙桐遗传多样性水平及空间分布格局和地史变迁信息，为珙桐遗传资源保护策略的制定提供种群遗传学基本信息。主要研究结果如下：
　　 (1)通过单因素试验和正交试验，确定优化的ISSR－PCR反应体系为：25μL反应体系，Mg2+1.8mM，DNA60ng，dNTP0.40mM，引物0.52μM，Taq酶1.25U。反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性45s，48℃～58℃退火45s，72℃延伸90s，36个循环；72℃总延伸7min；4℃保存。
　　 (2)利用ISSR分子标记对11个天然珙桐种群240个植株进行遗传多样性分析，结果为：利用优化的ISSR－PCR反应体系和程序，从100条引物中筛选出5条能扩增出稳定、清晰和多态性谱带的引物(UBC829、UBC841、UBC846、UBC848、UBC864)，共扩增出77个谱带，74个为多态性谱带，多态性谱带百分率(PPB)为96.10％；各种群PPB值为37.66％～63.64％，平均为54.07％。种内Shannon多样性指数(HSP)为0.4849，种群内Shannon多样性指数(HPOP)为0.1886～0.3274，平均为0.2774。这表明，珙桐物种、种群均维持较高的遗传多样性。分子方差(AMOVA)分析显示，种群间与种群内遗传变异分别占总遗传变异的46.22％、53.78％，种群间呈高度遗传分化(φst=0.4170)。种群问遗传距离(φst)与对应的地理距离呈正相关(r=0.546，P=1.619e-05)。UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic-means)法聚类分析将11个珙桐种群分为三组，即湖南桑植、湖南永顺、湖北兴山、湖北长阳为一组，湖北神农架和贵州梵净山、松桃为一组，四川峨眉山、四川雅安和贵州织金县为一组。
　　 (3)通过试验，确定优化的cpDNA非编码序列PCR扩增体系和程序为：25μL反应体系，50ng DNA，10 Taq Buffer(Mg2+free)，2.5mM MgCl2，0.4mM dNTPs，0.2μM primer1，0.2μM primer2，1.25U Pfu DNA Polymerase。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，退火45s，退火温度和72℃延伸时间依不同的引物和产物而不同，共35个循环，72℃总延伸7min，最后4℃保存备用。
　　 (4)利用cpDNA非编码序列标记对11个天然种群的240个植株进行谱系地理学分析，结果为：利用优化的cpDNA-PCR反应体系和程序从9对引物中筛选出3对引物(trnSGCU和trnGUUC、rps16-F和rps16-R、atpB-49和rbcL-188)，珙桐测序序列比对结果显示，11个天然珙桐种群共形成2种单倍型，具有两个变异位点，2种单倍型将11个珙桐种群分为2支，具有明显的地理位置特征。一支包括四川峨眉山、四川雅安、贵州织金县，地处中国的西南部；另一支包括湖南永顺、桑植、石门3个种群，湖北神农架、兴山、长阳3个种群，贵州梵净山、松桃2个种群，共8个种群，地处中国的中南部。此种系统分析结果与珙桐ISSR的UPGMA法聚类分析结果大体吻合。以上信息揭示11个天然珙桐种群可能起源于两种避难所种群，具有相同单倍型的珙桐种群起源于同一个避难所，起源过程中起主要作用的是奠基者效应(founder effect)。第四冰期后，各避难所的种群迅速扩大，形成现在的单一单倍型的珙桐种群。
　　 (5)基于珙桐ISSR分子标记分析和cpDNA非编码序列标记分析，本研究提出的珙桐资源保护策略为：尽可能地保护珙桐所有的天然种群原生境条件，禁止滥砍滥挖，以保护尽可能多的遗传变异。其中，优先保存四川峨眉山、湖南桑植和贵州梵净山等遗传多样性丰富度高的种群。由于珙桐天然更新困难，应积极采取珙桐天然林人为促进更新措施。另外，加强珙桐引种驯化和人工繁殖技术的研究，这不仅能缓解珙桐天然种群由于自身繁殖能力不足以及人为采挖造成对其生存的威胁，而且可以确保异地引种人工林开花结实，可持续生存繁殖。