油茶后期自交不亲和性的细胞学研究

摘要

油茶（Camellia oleifera Abel.）是我国南方重要的木本食用油料树种，在保障国家粮油安全和生态文明建设中占有重要地位和作用。然而油茶在生产中普遍存在的花多果少、座果率低的症结，导致油茶产量低且不稳定，这已成为长期严重制约我国油茶产业健康发展的瓶颈。前期初步研究表明油茶具有自交不亲和性，可能是导致油茶结实率低的重要原因之一。在此基础上发现油茶的自交不亲和性(IS)与传统定义的配子体自交不亲和性(GSI)存在明显差异，自交不亲和反应并非发生在花柱而是在子房中，具有后期自交不亲和性(LSI)的初步特征。基于此，本研究采用荧光显微观察法、人工授粉测定法和数值综合判定法对油茶后期自交不亲和性进行综合鉴定，明确了油茶后期自交不亲和性的类型及特征;采用石蜡切片结合光镜观察法和整体染色透明结合激光共聚焦显微镜观察法，从细胞水平对比研究自交与异交授粉后胚珠的显微结构;采用扫描电镜法和超薄切片结合透射电镜法，从亚细胞水平对比研究自交与异交授粉后花粉管与胚珠的超微结构。通过系统研究旨在阐明油茶后期自交不亲和性的类型特点和细胞学机制，为油茶育种和高效栽培提供理论基础。主要研究结果如下:
　　1.油茶后期自交不亲和性的鉴定。通过运用荧光显微观察法、人工授粉测定法和数值综合判定法对油茶授粉亲和性研究表明:油茶自交与异交授粉40 h后，花粉管均到达花柱基部，自交花粉管生长减缓，异交仍然正常生长;授粉后40 h～48 h期间，异交花粉管未在花柱基部停留，继续生长到达胚珠处并进入胚囊，自交花粉管在花柱基部接近子房处生长停滞、减缓，表现出异常明亮、末端膨大、分叉、卷曲、折叠、波浪状等不亲和反应，停滞在子房中。田间验证实验中自交授粉落果高峰在授粉后30 d～50 d期间，落果量占授粉量的2/3以上，异交未大量落果;果实成熟时异交座果率、结籽率显著高于自交;授粉120 d后，极少数受精成功的自交幼果内仅有1～2粒胚珠发育，其余胚珠褐化、干瘪，异交幼果中大多数胚珠正常发育;授粉后180 d，幼胚异交比自交发育程度深。通过P/O值判断油茶的繁育系统为专性异交类型;杂交指数OCI值判断油茶为异交型，需要传粉者;亲和指数判断油茶为自交不亲和植物。综合以上三种鉴定方法可以明确判定油茶为后期自交不亲和性植物，属于合子前作用类型。
　　2.油茶后期自交不亲和性的显微结构特征。通过运用石蜡切片结合光镜观察法和整体染色透明制片结合激光共聚焦显微镜观察法对油茶自交不亲和性反应中胚珠的研究表明:油茶开花时胚囊已发育成熟，自交中绝大多数胚珠由于花粉管未能进入胚囊发生双受精作用而从授粉后7d开始死亡、退化，这是成熟果实中败育种子的主要来源。自交中能观察到极少数胚珠的双受精过程，与异交中的双受精特征无明显差异，但在发生时间上不同，异交在授粉后54～120 h之间精细胞与极核（次生核）融合形成初生胚乳核，而自交在授粉后84～144 h之间发生，异交在授粉后66～144 h之间精细胞与卵细胞融合形成受精卵，而自交在授粉后102～150 h之间发生。去雄未授粉对照材料中胚珠同样由于未受精，从授粉后7d开始整个胚囊内的主要细胞逐渐裂解、死亡，胚珠收缩变形，这些现象同发生不亲和反应的自交未受精胚珠胚囊内变化情况基本一致。油茶在胚囊成熟时子房中存在一定比例的不育胚珠，这类胚珠通常位于子房室的中、下部，不育胚珠随着已受精子房的发育仍会继续增大体积，但在授粉后4个月左右停止体积增长，在后期的发育中逐渐干瘪、褐化，这也构成成熟果实中败育种子的另一来源。以上为油茶后期自交不亲和性反应中胚珠的显微结构变化特征。
　　3.油茶后期自交不亲和性的超微结构特征。通过运用超薄制片结合透射电镜观察法和扫描电镜观察法，在显微结构观测基础上对油茶自交不亲和性反应中花粉管和胚珠的研究表明:自交中花粉管即将到达花柱基部时开始出现局部膨大，管壁不平滑，当花粉管进入子房并生长停滞后出现膨大、分叉、卷曲、折叠和波浪状的现象是由于花粉管壁局部加厚造成的，分别呈现出“点状”、“片状”、“带状”加厚和“铠甲状”裂纹;花粉管壁自交比异交厚一倍以上，异交花粉管内含物高度液泡化，细胞器退化，自交花粉管内含物模糊不清，细胞器解体不可辨识。自交中绝大多数的未受精胚珠在授粉30 d后，珠孔口的细胞外分泌物、细胞器数量和种类减少明显，通道中的分泌物和球状造粉质体均消失。自交中极少数的受精胚珠中受精卵刚形成时，核周围聚集少许淀粉粒，授粉后30d，核周围的淀粉粒开始体积变大、数量增多，紧密围绕在核周围，合点端的细胞膜逐渐增厚，细胞壁也开始增厚，授粉后50d，细胞壁变得更厚。去雄未授粉对照材料中授粉后30 d的胚珠珠孔口处的细胞壁外分泌物甚少，珠孔通道间隙内分泌物也基本消失，造粉质体消失，胚囊内宿存助细胞退化变形，细胞质分散、大液泡退化、膜结构解体;卵细胞中也无完整细胞器，仅残留一些退化后的痕迹，极核（次生核）核质逐渐退化。以上为油茶后期自交不亲和性反应中花粉管和胚囊的超微结构变化特征。

目录

声明

摘要

1．1．1 油茶概况

1．1．2 油茶生产中的问题

1．1．3 课题的提出

1．2 油茶生殖生物学研究

1．2．2 雌、雄性器官发育与受精

1．2．3 胚和果实发育

1．3 植物种实败育的细胞学研究

1．3．1 雄性不育

1．3．2 雌性不孕

1．3．3 授粉受精障碍

1．3．4 胚、胚乳中途败育

1．4 被子植物后期自交不亲和性研究

1．4．1 自交不亲和性

1．4．2 后期自交不亲和性

1．5 本研究的目的意义、研究内容和技术路线

1．5．1 目的和意义

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 荧光显微观察法

2．2．2 人工授粉测定法

2．2．3 数值综合判定法

2．3 结果与分析

2．3．1 油茶雌蕊的结构特征

2．3．2 自交与异交花粉管在花柱中的生长行为

2．3．3 自交与异交花粉管在子房中的生长行为

2．3．4 自交与异交人工授粉田间验证

2．3．5 P／O值、杂交指数和亲和指数的判定

2．4 讨论

2．4．1 油茶后期自交不亲和性的综合鉴定

2．4．2 油茶后期自交不亲和性的发生特点

2．4．3 解剖学在鉴定生殖生物学事件中的优势

2．4．4 生产中科学合理配置授粉树的重要性

2．4．5 油茶生殖特性与育种工作

2．5 小结

第三章 油茶后期自交不亲和性的显微结构观测

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 石蜡切片(整染法)

3．2．2 石蜡切片(片染法)

3．2．3 整体染色透明制片结合激光共聚焦显微镜观察

3．3 结果与分析

3．3．1 成熟未受精胚珠的显微结构

3．3．2 异交中胚珠的双受精过程

3．3．3 自交中极少数胚珠的双受精过程

3．3．4 自交中绝大多数未受精胚珠的命运

3．3．5 去雄未授粉胚珠的命运

3．3．6 子房中的不育胚珠

3．4 讨论

3．4．1 油茶自交与异交双受精过程的特点和差异

3．4．2 油茶受精成功并能正常发育的条件

3．4．3 子房中的不育胚珠形成与发育

3．4．4 激光共聚焦显微镜在油茶胚囊观察中的运用优势

3．5 小结

第四章 油茶后期自交不亲和性的超微结构观测

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 超薄切片结合透射电镜

4．2．2 扫描电镜

4．3 结果与分析

4．3．1 成熟未授粉花柱与胚珠的超微结构

4．3．2 自交与异交花粉管的超微结构差异特征

4．3．3 异交中受精胚珠的超微结构变化

4．3．4 自交中未受精胚珠的超微结构

4．3．5 去雄未授粉胚珠的超微结构变化

4．4 讨论

4．4．1 花粉管在自交与异交受精过程中的变化特征

4．4．2 受精前后胚囊的超微结构变化

4．4．3 自交与去雄未受精胚珠的超微结构差异

4．5 小结

5．1 总结

5．1．1 油茶后期自交不亲和性的综合鉴定

5．1．2 油茶自交与异交雌蕊显微结构的对比研究

5．1．3 油茶自交与异交雌蕊超微结构的对比研究

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录

致谢