辣椒疫病拮抗菌的筛选及其发酵优化

摘要

辣椒是最重要的蔬菜作物之一，已被广泛应用作为食品、调味品和药品。辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)侵染引起的一种毁灭性土传病害，严重威胁着辣椒的种植与产量。由于长期使用化学药剂防治辣椒疫病，不仅造成了病原菌的抗药性，而且还威胁到了人类健康，造成了环境污染等问题，从而使高效且无毒无害、无污染、不易产生抗药性的生物防治成为了一个研究热点。本研究旨在采用稀释平板涂布法和对峙培养法，从土壤中分离筛选对辣椒疫病有显著抑制作用的拮抗菌，并对拮抗能力最强的菌株进行鉴定，研究该菌株的抑菌谱、促生、生防效果及其拮抗机制，并对其产芽孢的条件进行系统研究。主要结论如下: 1.从土样中分离到45株根际细菌，其中，菌株IBFCBF-4对辣椒疫病病菌拮抗能力最强，抑菌圈直径为22.25 mm;菌株IBFCBF-4对亚麻立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、亚麻炭疽病菌(Colletotrichum Linicolum Pethybr etLaff)、亚麻枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.f.sp.lini(Bolley) Snyder&H ans en)、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumebrium Owen）、油菜菌核病菌(Sclerotinia scleratiorum(Lib.) de Bary)均有抑制作用，菌圈直径均在16mm以上;菌株IBFCBF-4具有产吲哚乙酸、解磷和产氨能力;通过形态学观察、生理生化特性和16S rDNA序列分析，菌株IBFCBF-4被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 2.室内盆栽试验表明，菌株IBFCBF-4对辣椒疫病防治效率为64.45％;另外，菌株IBFCBF-4还能够显著地促进辣椒植株的生长，与对照相比，株高增加了11.82％，茎粗增加了5.36％，地上部分鲜重增加了16.89％，地上部分干重增加了25.13％，根鲜重增加了44.75％，根干重增加了47.37％。 3.初步研究其拮抗机制，发现菌株IBFCBF-4能导致辣椒疫霉菌丝变粗和分枝增多，并促进其厚垣孢子的形成;菌株IBFCBF-4能产蛋白酶和纤维素酶，还能产生对辣椒疫霉具有显著抑制作用的挥发性化合物、粗蛋白和粗脂肽，抑菌率分别为63.96％、46.48％和49.80％; PCR检测和BLAST分析表明，菌株IBFCBF-4的DNA中含有ituA、ituB、ituC、ituD、bamD、bmyB、fenB、srfAB、surf、 bacA、bacD、bacAB、tasA、mrsA和mrsM这15个与抗生素合成相关的基因，说明该菌株有合成Iturin A、Bacillomycin D、Fengycin、Surfactin、Bacilysin、TasA和Mersacidin的潜力。 4.通过响应面优化法得到菌株IBFCBF-4最佳产芽孢条件为:玉米粉16 g/L，黄豆粉10 g/L，CaCl21 g/L，39℃，220 rpm，pH7.5，接种量2％，装液量90 mL，发酵48 h，实测芽孢浓度为3.70×1010 cfu/mL，是优化前的130倍。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 辣椒

1．2 辣椒疫病

1．2．1 辣椒疫病病原菌

1．2．2 辣椒疫病发病规律

1．2．3 辣椒疫病发病症状

1．3 辣椒疫病的防治

1．3．1 农业防治

1．3．2 抗病育种

1．3．3 化学防治

1．3．4 生物防治

1．4 生防菌作用机制

1．4．1 竞争作用

1．4．2 诱导抗性作用

1．4．3 促生作用

1．4．4 拮抗作用

1．5 生防菌发酵优化

1．6 研究目的及意义

1．7 技术路线

2 拮抗菌的分离、筛选与鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 供试土样

2．1．2 供试病原真菌

2．1．3 培养基

2．1．4 主要试剂及仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 拮抗菌的分离与筛选

2．2．2 候选拮抗菌的抑菌谱测定

2．2．3 候选拮抗菌的促生特性

2．2．4 候选拮抗菌的形态学观察

2．2．5 候选拮抗菌的生理生化特征

2．2．6 候选拮抗菌的16S rDNA鉴定

2．2．7 数据统计与分析

2．3 结果与分析

2．3．1 拮抗菌的分离与筛选

2．3．2 菌株IBFCBF-4的抑菌谱

2．3．3 菌株IBFCBF-4的促生特性

2．3．5 菌株IBFCBF-4的生理生化特征

2．3．6 菌株IBFCBF-4的16S rDNA鉴定

2．4 小结

3 菌株IBFCBF-4防病效果及促生作用

3．1 实验材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 供试辣椒品种

3．1．4 供试土壤

3．1．5 主要试剂及仪器设备

3．2 试验方法

3．2．1 育苗及培养条件

3．2．2 辣椒疫霉孢子悬浮液的制备

3．2．4 防病试验

3．2．5 促生试验

3．2．6 数据统计与分析

3．3 结果与分析

3．3．2 菌株IBFCBF-4促生效果

3．4 小结

4 拮抗机制的初步研究

4．1 实验材料

4．1．1 供试菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 抗生素合成基因引物

4．1．4 主要试剂及仪器设备

4．2 试验方法

4．2．4 粗蛋白和粗脂肽对辣椒疫霉的抑制作用

4．2．5 抗生素合成基因克隆

4．2．6 数据统计与分析

4．3 结果与分析

4．3．3 菌株IBFCBF-4代谢产物对辣椒疫霉的抑制作用

4．3．4 菌株IBFCBF-4抗生素合成基因克隆

4．4 小结

5 菌株IBFCBF-4产孢发酵优化

5．1 实验材料

5．1．1 供试菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 主要试剂及仪器设备

5．2 试验方法

5．2．4 单因素试验

5．2．5 Plackett-Burman设计

5．2．6 最陡爬坡试验设计

5．2．7 Box-Behnken设计

5．2．8 验证试验

5．2．9 数据统计与分析

5．3 结果与分析

5．3．1 菌株IBFCBF-4的生长曲线

5．3．2 单因素试验结果

5．3．3 Plackett-Burman试验结果与分析

5．3．4 最陡爬坡试验结果

5．3．5 Box-Behnken试验结果与响应面分析

5．3．6 验证试验

5．4 小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 不足之处

6．3 展望

7 创新点

参考文献

附录

致谢